Resultados del análisis estadístico: χ2
crítico (1 g.l = 3,84) P< 0,05 como valor significativo
VI.7 Análisis de asociación entre los polimorfismos del gen VKORC1.
Debido a que en los análisis anteriores se ha observado una asociación entre los diferentes genotipos de los polimorfismos -1639G>A y 2255C>T en la población, en relación con la frecuencias genotípicas y alélicas, así como con la dosis de warfarina requerida por los pacientes, se evaluó por pruebas específicas si la presencia de los alelos mutados de ambos están ligados. Para ello, se consideraron las frecuencias genotípicas y alélicas de cada uno, tanto en controles como en pacientes. Se evaluaron los estadísticos; exacto de Fisher, razón de verosimilitudes y asociación lineal, los dos primeros con 4 grados de libertad y el último con un grado
de libertad. En la tabla XIV se resume el número de individuos por genotipo de cada polimorfismo. Los resultados del análisis mostraron una asociación entre ambos estadísticamente significativos (p< 0,0001) (Anexo 5). Puede comprobarse que los individuos, tanto controles como pacientes coinciden en una proporción apreciable en su genotipo, es decir, que los individuos expresan un genotipo heterocigoto GA, para el polimorfismo -1639G>A lo presentan también para el genotipo heterocigoto CT del SNP 2255C>T. El mismo resultado fue observado en sujetos con los genotipos homocigotos AA y TT de los mismos polimorfismos y en ambos grupos de estudio.
Tabla XV. Resumen de análisis de asociación entre los Polimorfismos de Nucleótidos Simples -1639G>A y 2255C>T en el gen VKORC1 en los grupos control y pacientes.
Controles Pacientes
2255C>T 2255C>T
Resultados del análisis estadístico:χ2
crítico (1 y 4 g.l) P< 0,0001 como valor significativo.
VI.8 Análisis de riesgo para dos polimorfismos: -1639G>A y 2255C>T del gen VKORC1 en relación a la Trombosis Venosa.
Debido a que los resultados anteriores señalan una asociación entre los diferentes genotipos de los SNPs -1639G>A y 2255C>T en la población, se seleccionaron estos dos polimorfismos para comparar la presencia del genotipo homocigoto mutado contra de la ausencia del mismo en pacientes y controles. Así como también se estimó el riesgo en la población de padecer trombosis venosa
CC CT TT Total GG 42 7 2 51 GA 13 58 13 84 -163 9G >A AA 1 3 11 15 Total 56 68 26 150 CC CT TT Total GG 42 8 1 51 GA 6 59 4 69 -163 9G >A AA 1 3 28 30 49 68 33 Total 150
cuando los individuos posean simultáneamente ambos genotipos mutados. Para ello se calculó el OR y se aplicó una prueba de χ2
partiendo de los datos obtenidos de esta investigación y señalados en la tabla XIV.
Los resultados indican que hay un riesgo aumentado a padecer de trombosis venosa cuando un individuo presenta simultáneamente el alelo mutado A del polimorfismo -1639G>A y el alelo mutado T del polimorfismo 2255C>T, ambos genotipos en condición homocigota. El OR obtenido fue de 2,703 (IC 95% 1,300 – 5,611) con un χ2 = 7,26 y un p valor = 0,007. Estos resultados fueron estadísticamente significativos en ambos grupos de estudio para un p<0,01 de significancia.
VI.9 Determinación del Desequilibrio de ligamiento entre los polimorfismos -1639G>A y 2255C>T del gen VKORC1
Debido a que es difícil definir cual de los genotipos de los polimorfismos analizados es el responsable de influir o modificar el riesgo de la enfermedad (trombosis venosa), se analizaron en conjunto dos de los cinco SNPs estudiados en el gen VKORC1 (-1639G>A y 2255C>T) debido a que se observó por resultados previos, que ambos tienen cierto grado de correlación o asociación estadística. Esta asociación es denominada Desequilibrio de Ligamiento. Para ellos se determinaron las frecuencias alélicas y gaméticas, tanto las esperadas como las observadas en el grupo control, partiendo de los datos resumidos en la tabla XIV, los cuales permitieron determinar el desequilibrio de ligamiento aplicando un χ2. Los resultados indican que el desequilibrio (D) fue distinto de cero, obteniéndose un valor de χ2= 26,995 con un grado de libertad, un intervalo de confianza del 95% (2,194-5,834) y un P<0,0001. Se determinó que los polimorfismos -1639G>A y 2255C>T se encuentran en desequilibrio de ligamiento en el grupo control.
VII. DISCUSIÓN
La incidencia de trombosis venosa en los individuos de una población se ve influenciada no sólo por la suma de factores adquiridos (ambientales), sino que juega un papel importante las variaciones genéticas inherentes de cada individuo (Lacut y col., 2007). En conjunto, todos estos factores contribuyen con el desarrollo de dicha patología, considerada como una de las causas de morbilidad y mortalidad, tanto en nuestra población como a nivel mundial. Si bien en algunos casos el origen de la enfermedad es conocida, en otros no lo es, por lo que la investigación en esta área ha cobrado interés en los últimos años, principalmente porque se hace difícil tratar a los pacientes con trombosis, los cuales en la mayoría de los casos no responden bien a la terapia primaria con anticoagulantes orales.
La warfarina es el anticoagulante por elección y una de las principales drogas usadas en la terapia y la prevención de enfermedades trombóticas a nivel mundial (Sconce y col., 2005. D’Andrea y col., 2005). Sin embargo, exhibe una amplia variabilidad en cuanto a la dosis requerida y a la respuesta en los pacientes (Limdi y col., 2010) y Las investigaciones de la farmacocinética de la warfarina indican que los factores genéticos explican en gran parte esta variabilidad (Wadelius y Pirmohamed, 2007).
En el estudio de enfermedades genéticamente complejas juega un rol importante los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) (Zhang y col., 2005). En la actualidad es usado con frecuencia los genotipos de algunos SNPs como marcadores genéticos para establecer asociación entre variables de una población (variables genéticas) y determinado fenotipo (riesgo de enfermedad). Generalmente, establecer una relación estadística entre las variables, es posible cuando se desarrollan estudios de casos-controles donde se valora el componente genómico respecto a otros factores de tipo ambiental o adquirido, en el riesgo a desarrollar la enfermedad (Sevilla, 2007). Se recomienda por tanto hacer una combinación en la selección en el gen de interés, de los polimorfismos a estudiar, donde se evalúe tanto
las variantes funcionales que pueden contribuir a la enfermedad, así como aquellas regiones regulatorias de la expresión genética que son conservadas, debido a que éstas en conjunto son regiones regulatorias importantes.
Partiendo de este principio, en este trabajo se analizaron mediante PCR-RFLP, cinco SNPs ubicados en regiones distintas en el gen VKORC1: -1639G>A, 106G>T, 698C>T, 2255C>T y 3730G>A que abarcan desde la región promotora hasta la región 3’ no traducida, incluyendo el primer exón así como, el primer y segundo intrón. Este análisis fue hecho en una población constituida por 300 individuos (150 pacientes y 150 controles) con el objeto de investigar la relación de los genotipos de estos polimorfismos con la respuesta a la dosis de warfarina y con el desarrollo de la trombosis venosa.
La determinación de la frecuencia genotípica y alélicas de los cinco polimorfismos estudiados en el gen VKORC1, permitieron estudiar parte de la población venezolana sometida a tratamientos continuos con anticoagulantes orales de tipo cumarínico como la warfarina. Varias investigaciones previas sostienen la importancia de investigar el efecto de los diferentes genotipos de los SNPs sobre la regulación de la dosis de este fármaco. Como se mencionó anteriormente, una de ellas fue la realizada por Rieder y colaboradores (2005), quienes establecieron una clasificación por haplotipos en la respuesta al tratamiento. Estos autores distinguen dos grupos, el grupo A, que fue asociado con dosis bajas de warfarina y el grupo B asociado a altas dosis. En ambos casos estas diferencias en la respuesta fue explicada por los diversos niveles de expresión hepática de la proteína VKORC1 (Rieder y col., 2005).
Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple -1639G>A en el gen VKORC1
Con relación a las frecuencias alélicas y genotípicas encontradas del polimorfismo -1639G>A del grupo de pacientes, se observó que está en equilibrio de Hardy Weinberg y fue comparable a la reportada en otros trabajos (Sconce y col.,
2005; Zhu y col., 2007; Scott y col., 2008). La frecuencia del alelo G encontrada en la población de pacientes en este estudio fue de 57% y la del alelo A en un 43%, igual a la frecuencia reportada por Sconce en el 2005 para los mismos alelos en una población de pacientes estudiada en el Reino Unido. El resultado obtenido en el presente estudio también fue similar al hallado en dos poblaciones Judías, Ashkenazi y Sephardi, donde encontraron 53,3% y 50% para el alelo G y 56,7% y 50% para el alelo A, respectivamente (Scott y col., 2008). Por su parte, en lo que respecta a las frecuencias genotípicas encontradas en el grupo de pacientes investigados en este trabajo, se observó que el genotipo homocigoto mutado AA fue de 20%, a diferencia de la encontrada en la población asiática la cual alcanza un 82,1% (Yuan y col., 2005). Para los genotipos homocigoto normal (GG) y heterocigoto (GA) estas fueron menores en comparación con los valores obtenidos en los individuos con el genotipo AA. En este trabajo se encontró en el grupo de pacientes una frecuencia del 46% para el genotipo GA frente al 17,9% y al 46,7% reportado en pacientes chinos y caucásicos, respectivamente (Yuan y col., 2005). Se han encontrado diferencias de acuerdo al origen étnico y ello se ha correlacionado con la presencia del alelo mutado A del polimorfismo. Este alelo está asociado a la sensibilidad a la warfarina de los pacientes. En un estudio realizado en varias poblaciones de diferentes orígenes étnicos del mundo: Asiáticos, Blancos, Hispanos, Africanos – Americanos, se observa como esta diversidad influye fuertemente en la distribución de la dosis, siendo baja para los primeros y alta para los últimos, encontrándose asociación con la presencia del alelo A del polimorfismo (Johnson, 2008).
Durante los últimos años, los pacientes con trombosis venosas han sido tratados siguiendo las recomendaciones del Consorcio Internacional de Farmacocinética de la Warfarina (IWPC, 2009). Este consorcio estableció tres rangos terapéuticos de acuerdo a la construcción de algoritmos donde se consideran la dosis del fármaco según las variantes alélicas del polimorfismo -1639G>A (alelo G y Alelos A) y de los genotipos de éste SNP, en las diferentes poblaciones mundiales. Pacientes quienes requieren menos de 21 mg por semana (bajas dosis), aquellos
que necesitan dosis intermedias (entre 21 y 49 mg de droga por semana) y pacientes que requieren más de 49 mg por semana (altas dosis). En este trabajo se encontró, que la dosis de warfarina que reciben diariamente el grupo de pacientes estudiados con el SNP -1639G>A varió desde 6,303 mg/día para el genotipo homocigoto normal GG, 4,645 mg/día para los pacientes heterocigotos GA, hasta 3,946 mg/día para los individuos homocigotos mutados AA (Tabla XII). Estas dosis recibidas por los pacientes corresponden a una terapéutica de respuesta normal y estable, es una dosis que no les ocasiona a los pacientes efectos secundarios ni alteraciones en su coagulación. Éste rango terapéutico recibido por estos pacientes está en concordancia con la dosis establecida por el Consorcio Internacional de Farmacocinética de la Warfarina para los mismos genotipos de este polimorfismo. Los resultados obtenidos tanto en este trabajo como en los reportados por otros (Sconce y col., 2005; Scott y col., 2008; IWPC, 2009), concuerdan en que la presencia del alelo A, debe modificar la respuesta a la droga y condiciona al uso de una menor concentración en la dosis. Los resultados obtenidos en el presente trabajo (estadísticamente significativos) se apoyan en el análisis de varianza y de correlación entre la dosis y el polimorfismo, donde estos cambios en el polimorfismo sólo pueden explicar el 17,9% de la variabilidad en la dosis de warfarina (Tabla XII). Esto coincide con los porcentajes de variabilidad presentado por dos poblaciones diferentes: asiáticos y blancos 18,4% y 22,5%, respectivamente. En estas poblaciones fueron comparados los diferentes genotipos del SNP -1639G>A con la dosis de warfarina recibida (Limdi y col., 2010). Podría considerarse, de acuerdo a los resultados obtenidos y a las investigaciones previas que el alelo A del polimorfismo -1639G>A es un alelo que confiere una respuesta de sensibilidad, mientras que el alelo G puede otorgar cierta respuesta de resistencia al tratamiento con warfarina.
El polimorfismo -1639G>A, está ubicado en la región promotora del gen, específicamente se encuentra en el segundo nucleótido una E-box (CA/GNNTG) la cual se encuentra cercana a tres cajas más a muy corta distancia (200 pb). Se ha sugerido que estas cajas son un sitio importante para mediar la transcripción tejido específico, como el músculo, neurona, hígado y páncreas. Yuan y colaboradores en
el 2005, empleando ensayos de actividad con luciferasa evaluaron la actividad del promotor. Para ello, realizaron construcciones donde fusionaron el promotor conteniendo los diferentes genotipos del polimorfismo -1639G>A (genotipo GG y AA), a el gen reportero (luciferasa) para posteriormente, transfectar ambas construcciones genéticas en células de hepáticas de mamífero (HepG2), debido a que estos dos genotipos tienen unos altos niveles de expresión en hígado. A través de los niveles de luciferasa, los investigadores encontraron que la actividad transcripcional en presencia del alelo G fue un 44% más alta comparado con el alelo A. Por lo tanto sugieren que el cambio que ocurre en el segundo nucleótido de la secuencia consenso de la E-Box (CA/GNNTG) aumenta la actividad del promotor en el VKORC1 (Yin y Miyata, 2007), posiblemente evitando la unión de algún represor y en consecuencia aumentando los niveles de VKORC1. Estos resultados están apoyados por los obtenidos por Rieder y colaboradores (2005), los cuales cuando examinaron los niveles de expresión del ARN mensajero de VKORC1 en tejido de hígado humano, encontraron que éste fue significativamente más alto (alrededor de tres veces más) en el grupo con el haplotipo que cursa con altas dosis (grupo B) el cual contiene el alelo G del polimorfismo -1639G>A) en comparación con el grupo de bajas dosis (grupo A, el cual contiene el alelo A del dicho polimorfismo). Estos resultados podrían explicar la asociación que existe entre el alelo A del polimorfismo y la variabilidad individual en la dosis de warfarina, la cual podría deberse a una disminución de los niveles de ARN mensajero de VKORC1.
Así, lo anterior explica porque los individuos con el genotipo GG requieren de altas dosis, ya que en presencia de este nucleótido la actividad del promotor está aumentada, la expresión de ARN mensajero se eleva, incrementándose así los niveles de la proteína VKORC1 (Yuan y col., 2005). Un incremento en esta proteína contribuye a la generación de una mayor cantidad de vitamina K reducida, la cual a su vez podrá contribuir a la γ-carboxilación de los factores de coagulación dependiente de vitamina K. De esta manera, se activaría una mayor cantidad de estos factores de coagulación, haciendo que sean mayores los requerimientos de warfarina para garantizar la anticoagulación.
Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 106G>A en el gen VKORC1
En cuanto al análisis del polimorfismo 106G>T, en este trabajo se observó que en el 100% de la población estudiada, que incluye tanto el grupo de pacientes como de controles mostraron ser genotípicamente homocigotos normales (GG), esto se corresponde con una frecuencia del alelo G del 100% en la población analizada. Este porcentaje genotípico y alélico es muy similar al reportado por Scott y colaboradores (2008), quienes encontraron un 95,7% del alelo normal G y 4,3% del alelo mutado T para una de las dos poblaciones Judías en estudio (Ashkenazi). En el otro grupo poblacional que estudiaron estos autores (Shepardi), encontraron un 99,4% para el alelo G y un 0,6% para el alelo T (Scott y col., 2008).
En este trabajo, la dosis media de warfarina que requieren los pacientes con trombosis venosa y que expresan el genotipo GG del SNP 106G>T es de 5,084 mg/día (equivalente a 35,8 mg/semana, una dosis intermedia de warfarina) (Tabla XII). Estos requerimientos están más relacionados con dosis intermedias establecida entre los 20 y 70 mg/sem y coincide con el grupo control de otros trabajos realizados en población Sueca, Judía y de Etiopia, donde la variabilidad en los requerimientos se ve influenciada no sólo por factores genéticos, sino también por la edad y la masa corporal, llegando a explicarse por todos estos factores un 62% esta variabilidad en la dosis intermedia requerida en este grupo control. Estos autores en su trabajo encontraron un grupo de individuos que requerían de dosis más elevadas del fármaco (alrededor de 80 miligramos semanales) en comparación con la dosis requerida por el grupo anterior, estos sujetos fueron encontrados como portadores del cambio alélico o con el genotipo homocigoto mutado (TT) del polimorfismo 106G>T (Lobestein y col., 2007).
Tal como se ha señalado previamente, el cambio de una G por una T origina una mutación sin sentido en el primer exón del gen VKORC1, conllevando a la
sustitución del aminoácido ácido aspártico (D o Asp) en la posición 36 de la proteína por una tirosina (Y o Tyr). Este cambio ocurre muy cerca de la cisteína 43, un residuo conservado en la estructura de la proteína en varias especies y muy próximo a los residuos que forman parte del centro activo de la enzima. Probablemente esta modificación interfiere en la estructura terciaria de la proteína VKORC1 en el segundo motivo α hélice de la región transmembrana, el cual se extiende desde la posición 101 a la 123. Este segundo motivo a su vez está ubicado muy cerca del sitio de unión a la warfarina y al motivo redox de la proteína (figura 7), lo que probablemente ocasione un incremento en los requerimientos en la dosis del anticoagulante (warfarina). (Tie y col., 2005. D’Ambrosio.y col., 2007). Esto apoya lo reportado por Harrington y colaboradores (2008) quienes señalan que posiblemente, la mutación y específicamente la presencia del alelo mutado T en el gen genere modificación en la región entre la membrana y el primer lazo de la proteína ocasionando un cambio en ese dominio y una reducción en la unión de los cumarínicos (como la warfarina) a esta estructura, generando de esta forma una resistencia al fármaco.
El efecto previamente señalado de resistencia al fármaco ha tratado de ser explicado por diversos estudios realizados por otros autores (Oldenburg 2005. Oldenburg y col., 2007. D’Ambrosio y col., 2007). En esos estudios se investigó la sustitución nucleotídica en este polimorfismo (106G>T) en diferentes grupos de individuos (en europeos, judíos y sujetos de Reino Unido) identificándose por secuenciación, el cambio molecular y la modificación en la estructura de la proteína. Específicamente, Harrington y colaboradores (2008), estudiaron varias sustituciones nucleotídicas en el gen VKORC1, que estaban asociadas con la farmacocinética de resistencia a la warfarina, una de ellas fue la sustitución nucleotídica del polimorfismo 106G>T. Este estudio fue realizado únicamente en 15 sujetos con enfermedad trombótica venosa, de los cuales sólo 8 presentaron 4 modificaciones (sustituciones) nucleotídicas (p.V66M, p.L128R, p.V45L o p.D36Y) . A pesar de estar relacionados a la resistencia, estos individuos no cursaron con complicaciones en el tratamiento, por lo que los investigadores concluyeron que las mutaciones asociadas a la resistencia
de la warfarina reducen la potencia anticoagulante, sugieren que pueden ser un efecto combinado sobre las posibles modificaciones estructurales que pueda presentarse en la proteína, pero éstas no causan defectos importantes en la función reductasa de la VKORC1. Como el lugar donde ocurren las sustituciones esta ubicado muy cerca del lazo citoplasmático en la estructura de la proteína VKORC1, los investigadores sugieren a esta región como un candidato para las sustituciones nucleotídicas, alterando la estructura de la proteína, reduciendo la unión en ese dominio de parte de los cumarínicos y causando resistencia a la warfarina (Harrington y col., 2008).
Análisis del Polimorfismo de Nucleótido Simple 698C>T en el gen
VKORC1
Otro polimorfismo estudiado en el presente trabajo y cuyo alelo mutado se ha asociado con cierta resistencia a la terapia con anticoagulantes orales es el 698C>T, ubicado en el primer intrón del gen VKORC1. Éste conforma el grupo B de los haplotipos establecido por Rieder y colaboradores en el 2005. Específicamente al haplotipo VKORC1*1 por el alelo C y al VKORC1*4 por el alelo T (Reitsma, 2007). Se observó que este polimorfismo está en equilibrio de Hardy Weinberg. En la población en estudio, los genotipos fueron encontrados sólo en condición homocigota normal (CC) y en condición heterocigota (CT). La frecuencia de individuos portadores del cambio nucleotídico fue similar entre el grupo control y pacientes (Tabla VIII). Específicamente el genotipo CC se encontró en un 86% para los controles y en un 83,3% para los pacientes, mientras que el genotipo CT en un 14% y 16,7%, respectivamente. Estos resultados son comparables por los encontrados en el 2006 por Osman y colaboradores, los cuales reportaron que la frecuencia genotípica fue