Evaluation of Quality of Life using Quality of Life Instruments

Los elementos repetitivos que se utilizan en la técnica rep-PCR (repetitive element sequence-based PCR) se encuentran repartidos en todo el genoma bacteriano y pueden estar presentes en ambas orientaciones. Se han identificado tres familias de secuencias repetitivas: los elementos Extragénicos Palindrómicos Repetitivos (REP) (repetitive extragenic palindromic) de 35-40 pb, las secuencias Repetitivas Intergénicas Consenso de las Enterobacterias (ERIC) (enterobacterial repetitive intergenic consensos) de 124 a 127 pb y el elemento BOX de 154 pb (58)(15). A partir de la amplificación selectiva de estas secuencias se puede hacer un análisis

tipo fingerprint o huella ge ó i a o alta ep odu i ilidad ue pe ite disti gui

individuos, clones o genotipos (15). Se reportó la existencia de elementos repetitivos en los genomas de Burkholderias (20). El procedimiento global para llevar a cabo la caracterización molecular por fingerprinting se indica en el esquema de la Figura 6.

.

Figura 6: Esquema general de trabajo para la caracterización molecular mediante la técnica de fingerprinting

3.2.1. BOX-PCR (Conserved sequence BOX element of Streptococcus pneumoniae)

El ADN total se preparó como se ha descrito anteriormente (capítulo II) luego se diluyó

hasta o te e u a o e t a ió de g/μl. E este aso el p i e utilizado fue el BOX-A1R (Tabla 2). Este primer se empleó con la finalidad de obtener diferentes perfiles de fingerprint de ADN de los distintos aislados estudiados. La mezcla de reacción se preparó en un volumen

fi al de μl o , μl de Taqpoli e asa I it oge , B asil , μl de Buffe R X, , μl de MgCl2, μl de dNTPs deo i u leótidos t ifosfato M , , μl de agua destilada g de

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RAD, USA) de la siguiente manera: un ciclo de 94 °C por 2 minutos para desnaturalizar el molde; 38 ciclos de 94 °C por 20 segundos, 50 °C por 1 minuto y 65 °C por 6 minutos y finalmente un ciclo de 65 °C por 10 minutos (14) (15) (46).

3.2.2. ERIC-PCR (Enterobaterial Repetitive Intergenic Consensus)

“o e el olde de ADN ajustado a u a o e t a ió de g/μl se ealizó la ea ió de

PCR empleando los cebadores ERIC1 y ERIC2. (Tabla 2). La mezcla de reacción se preparó en un volumen fi al de μl o te ie do , μl de Taqpoli e asa I it oge , B asil ; μl de Buffe

R X; , μl de MgCl ; μl de dNTPs M; μl de ERIC μl de ERIC ; agua destilada

25ng de DNA molde (de Brujin, 1992). Luego de un ciclo de desnaturalización inicial de 2 minutos a 94 °C, se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación, cada uno consistiendo de tres pasos: 20 segundos a 94 °C; 1 minuto a 50 °C y 8 minutos a 65 °C. Finalmente se realizó un ciclo de extensión de 15 minutos a 65 °C. (15) (46).

3.2.3 REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic)

Sobre la preparación del ADN (entre 25- g/μl de olde se ag egó la ez la de ea ió de olu e fi al μl. “e utiliza o e este aso p ol/μl de ada u o de los

primers (REP1 y REP2) (Tabla 2), 1,25mM de desoxinucleótidos trifosfato, Buffer Rxn 5X; 2 U de Taq polimerasa y agua destilada. El ciclado aplicado fue el siguiente: un primer ciclo de desnaturalización a 95 °C por 6 minutos; 30 ciclos a 94 °C por 1 minuto, 40 °C por 1 minuto y 65 °C por 8 minutos y finalmente un ciclo de extensión a 65 °C por 16 minutos (15)(46).

Tabla 2: Cebadores utilizados en PCR-Fingerprinting.

Nombre Secuencia Reference

BOX-A1R Fw-1 5´- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - 3´ (15) ERIC1R-I Fw-1 5´- ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC - 3´ (15) REP1R-I Fw-1 3´- CGGICTACIGCIGCIIII – 5 (15) REP2-I Rv-2 5´- ICGICTTATCIGGCCTAC - 3´ (15)

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3.2.4 Análisis de los productos de PCR obtenidos por rep-PCR

En el caso de los productos de amplificación del gen recA y sus productos de digestión con enzimas de restricción, se emplearon para su separación geles de agarosa al 2% en TBE 0,5X corridos a 80mV por 150 minutos.

Los productos de PCR fingerprinting (ERIC-, BOX-, REP-PCR) fueron resueltos en geles de agarosa al 1,5% en 0,5X TBE. El tiempo de corrida fue de 10 minutos a 45 mV y luego 90 minutos a 90mV con la finalidad de conseguir una separación adecuada de las bandas. La

ti ió o B o u o de Etidio g/ l se lle ó a a o ag ega do μl del is o ada l

de agarosa fundida. La tinción se visualizó por medio de luz UV (306nm) y se tomaron fotografías con el Sistema Digital Kodak. Los ensayos fueron realizados por duplicado. Se incluyó un marcadores de peso molecular cada 18 calles para facilitar la normalización posterior de los geles (15).

3.2.5 Análisis de geles obtenidos por rep-PCR

Las imágenes obtenidas de los geles se digitalizaron y convirtieron a formato TIFF con la finalidad de llevar a cabo el análisis de los perfiles de fingerprint obtenidos. Con este fin se utilizó el software GEL Compare II (versión 2.1Applied Maths, Kortrijk, Bélgica). Cada imagen fue convertida con una resolución de calle de 250 y normalizada (resolución, 900; smoothing 5 puntos; sustracción de background rolling disk intensity, 12) usando el marcador de peso molecular Lambda ladder (Bio-Rad) como referencia. Se determinó que los perfiles con dos o más bandas de diferencia entre sí se consideraban no relacionados. La variación en la intensidad de las bandas no se consideró como una diferencia genética. Las bandas más débiles no se incluyeron en el análisis. El análisis de similitud de los resultados para cada

e sa o fue al ulado utiliza do el oefi ie te de Di e el a álisis de lúste s ge e ados po

matrices de similitud se realizó usando el método de UPGMA (Unweighted Pair Group Meted with Arithmetic Mean) (14). El criterio para definir clones relacionados fue considerar perfiles con el 85% o más de bandas similares. Este valor se considero deliberadamente alto de similitud con la que definir tipos de cepas en este estudio. El valor de corte adecuado para ser aplicado en un estudio epidemiológico es dificil determinar a priori, ya que es una función de la diversidad genética dentro de las especies investigadas, el poder de discriminación del método de tipificación utilizado y la cuestión epidemiológico está abordando (12). En un estudio anterior, un corte parecido BOX-PCR de 70% se considera más apropiado para evaluar la estructura de la población mundial de B. cenocepacia (12)En el presente estudio, en el que pocos centros FQ participaron y se hicieron comparaciones de cepas recuperadas durante

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períodos de tiempo relativamente cortos, un punto de corte superior era necesaria para proporcionar una definición más rigurosa de clonalidad.