Heidegger and this study

2.6.1. Cultivos en biofilm en sistema batch empleando perlas de polipropileno como soporte

Para estudiar la capacidad de formación de biofilm de aislados clínicos de B. contaminans se realizaron cultivos en sistema tipo batch los cuales se emplearon como inóculos. Los cultivos en biofilm fueron iniciados a partir de suspensiones de células planctónicas con una DO650 de 0,2 a 0,8. Los resultados obtenidos se utilizaron para elegir una

DO inicial para los restantes siguientes experimentos.

Para el cultivo en biofilm empleando un sistema de crecimiento tipo batch, se utilizaron tubos de vidrio los cuales contenían como soporte 3 g de perlas de polipropileno ( = 4,2 mm, h = 2 mm; Petroken, Argentina). Los tubos esterilizados se inocularon con 3 ml de suspensión bacteriana en caldo LB y se dejaron durante distintos tiempos 0.5, 1, 2, 3, 4, 24, 48 y 72 h en condiciones estáticas. Cada tubo representaba un tiempo de crecimiento. Después de 24 h el medio fue cambiado por LB fresco. A cada tiempo indicado, los cultivos fueron detenidos, retirando el medio de cultivo y las perlas, las cuales se lavaron tres veces con solución de PBS estéril para eliminar las células no adheridas al soporte. Los biofilm se fijaron luego a las perlas por secado durante 1 hora a 60 °C. La biomasa adherida se evaluó por tinción con cristal violeta (CV). La tinción se realizó cubriendo las perlas con solución de CV al 0,1% durante 15 minutos, luego las perlas se lavaron tres veces con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. ElCV unido a la biomasa adherida se eluyó mediante la adición de dos volúmenes de etanol al 95% y se midió la Absorbancia a 590 nm en espectrofotómetro. Para obtener la desviación estándar, se evaluaron cuatro muestras de cada experimento. Se tomaron como blanco perlas de polipropileno sin crecimiento de biomasa que fueron teñidas con CV.

2.6.2. Formación de biofilm en placas multipocillo

La capacidad de formación de biofilm fue ensayada en placas multipocillo empleando la metodología descripta por O’Toole olegas o odifi a io es e o es (60). Aislados de B. contaminans fueron replicados en agar tripticase soja (ATS; Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) y luego crecidos durante la noche en caldo LB (Britania, Buenos Aires, Argentina). Luego de ajustar la DO650 a 0,2 para cada cultivo empleando medio LB fresco, los mismos se usaron

como inóculos agregando 200 μl so e ada u o de los po illos de u a pla a de poliesti e o de 96 pocillos (Kartell, Italia). Las placas se incubaron durante 4 h a 37 °C sin agitación, se retiró el medio con células no adheridas y se adicionó medio fresco estéril. Posteriormente las placas se

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incubaron durante 48 h a 37 °C con agitación orbital de 100 r.p.m., con remplazo total del medio de cultivo a las 24 h. Los biofilms formados sobre la superficie de los pocillos fueron lavados suavemente dos veces con PBS y luego teñidos con 0,1% de cristal violeta (CV) por 15 minutos. Los pocillos fueron luego lavados 3 veces con agua, secado en estufa a 60 °C y finalmente el CV asociado a la células fue solubilizado con etanol al 95% (v/v). De esta forma la biomasa fue cuantificada indirectamente midiendo la Absorbancia a 590 nm (A590) del CV

disuelto usando un lector de placas multipocillo (Benchmark Plus, Biorad). Para cada cepa fueron realizados en paralelo 3 experimentos independientes con 5 réplicas cada uno. Controles del medio no inoculado (DOc) fueron incluidos en cada ensayo. El valor de corte fue definido como tres desviaciones estándar sobre la media del DOc.

Posteriormente, se evaluó otro diseño experimental de crecimiento de cultivo empleando el sistema de placas multipocillo. Se ensayaron 3 condiciones: A) inóculo DO650 0,2

sin recambio de medio de cultivo; B) inóculo DO650 0,2 con recambio de medio de cultivo a las

24 h; C) inóculo DO650 0,02, con recambio de medio de cultivo a las 24 h, todas con incubación

estática inicial de 4 h.

2.6.3. Cultivo en biofilm en cámaras con flujo continuo de nutrientes

El sistema de cultivo en biofilm en cámaras operadas con flujo continuo de nutrientes, consistió en el empleo de celdas rectangulares de acrílico de 3 x 10 x 1cm, de tamaño, diseñadas en nuestro laboratorio. Cada celda se conectó por un extremo y por medio de tubos de silicona, a un frasco Erlenmeyer de 250 ml de capacidad que cumplió la función de reservorio para el inóculo, y a un recipiente de 1 L, el cual almacenó el medio de cultivo fresco. Este último recipiente se conectó mediante un tubo de silicona a un filtro el cual estaba asociado a un aireador con el fin de aportar de este modo aire estéril al medio de cultivo fresco. Por el otro extremo, el biorreactor fue conectado a un Erlenmeyer de 0,5 L el cual fue utilizado como reservorio del medio de cultivo agotado (Figura 2). El sistema de cultivo completo fue esterilizado con vapor. Este sistema se completó con una bomba peristáltica multicanal (GIBSON, Francia) para permitir la circulación del medio de cultivo a través de la celda de cultivo. La cámara fue inoculada con 1 ml de un cultivo planctónico en fase exponencial, al cual se le ajustó previamente la DO650 a 0.5 con medio LB. La suspensión celular

se mantuvo en contacto con la superficie de crecimiento de manera estática, en cuarto estufa a 35 °C durante 4 h, para permitir de esta manera la adhesión de las células a la superficie. Posteriormente se inició la circulación de medio LB fresco a través de la celda, por acción de la bomba peristáltica, la cual se trabajó a una velocidad constante de 2,21 ml h-1 _{y se drenó la}

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mantuvo bajo condiciones de aireación constante (0,1 L min-1_{), mientras que el sistema}

completo de cultivo se mantuvo a 35°C. La biomasa adherida al soporte abiótico fue evaluada a las 48 h de iniciado el cultivo. A tal fin, luego del período de tiempo mencionado, se detuvo la circulación del medio fresco, se drenó el medio de cultivo contenido en la cámara y se procedió a fijar el biofilm crecido con p-formaldehido 4% (v/v) por 15 minutos, luego se lavó por circulación suave de PBS por acción de la bomba peristáltica. Finalmente se coloreó con solución de naranja de acridina (5 mg/L) y se observó por microscopía de escaneo láser confocal (Figura 2).

Figura 2. Esquema del sistema de cultivo en biofilm en cámaras operadas con flujo contínuo de nutrientes. Las celdas son diseño original.