Las restricciones paramagnéticas que hemos presentado hasta ahora, R1dip y pcs, están
relacionadas con parámetros estructurales mediante expresiones matemáticas deducidas teóricamente (ecuaciones 16 y 7). Sin embargo, no hay ninguna teoría que relacione, de forma general, el desplazamiento de contacto, δcon, observado para un determinado núcleo con
propiedades estructurales. La carencia de una expresión matemática general es debida a que este tipo de relaciones depende no sólo de los mecanismos operativos que contribuyen al desplazamiento de contacto (Capítulo 2 de la Introducción), sino también de la naturaleza del metal, de los ligandos, de la geometría de coordinación, etc. En definitiva, sólo se puede plantear correlacionar el desplazamiento de contacto con propiedades estructurales desde un punto de vista empírico. De hecho sólo mediante la comparación de estos desplazamientos en sistemas análogos se han podido encontrar tales relaciones. En el caso de las proteínas hierro-azufre, se ha encontrado una dependencia entre los δcon de los protones-β y carbonos-α de las cisteínas
coordinadas a los iones hierro y el ángulo diedro Fe-Sγ-Cβ-Cα, mediante una relación tipo Karplus y su parametrización correspondiente457. En proteínas hierro-azufre se han aplicado estos parámetros
otro tipo de proteínas y, en consecuencia, queda restringido hasta la fecha el uso de los δcon a estos
2. Orientación Molecular
2
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OOOOrrrriiiieeeennnnttttaaaacccciiiióóóónnnn MMMMoooolllleeeeccccuuuullllaaaarrrr
2.1.
2.1.
Acoplamientos Dipolares Residuales Acoplamientos Dipolares Residuales
Todos los núcleos activos en RMN (I 0) generan momentos magnéticos cuando se introducen en un campo magnético. Estos momentos interaccionan dipolarmente (a través del espacio) entre sí. En RMN de estado sólido, los momentos magnéticos no cambian su orientación relativa, ni tampoco con respecto al campo magnético externo, por lo que el acoplamiento dipolar es muy intenso. Además, al poseer cada núcleo una orientación diferente, existe una elevada anisotropía magnética que origina un conjunto de desplazamientos químicos muy diverso para un mismo núcleo (anisotropía del desplazamiento químico o csa). Debido al acoplamiento dipolar y a la anisotropía magnética existente en muestras sólidas, los espectros de RMN de sólidos presentan señales con anchuras del orden de kHz. Estos dos parámetros proporcionan una alta información estructural de las muestras, aunque, al mismo tiempo, originan una muy baja resolución intrínseca de los espectros, por lo que sólo se pueden estudiar sistemas relativamente simples. Para obtener mayor resolución en estado sólido se debe recurrir a técnicas que eliminen los intensos acoplamientos dipolares. Un ejemplo de estas técnicas es el denominado RMN de alta resolución mediante giro alrededor del ángulo mágico (High Resolution Magnetic Angle Spinning, HRMAS)460.
En RMN en disolución la situación es completamente distinta. Los acoplamientos dipolares se eliminan casi en su totalidad. En efecto, el movimiento de rotación molecular promedia todas las orientaciones de los momentos magnéticos y su suma resulta prácticamente nula. Como consecuencia, las señales de un espectro de RMN en disolución son señales estrechas y bien resueltas. No obstante, aunque el acoplamiento dipolar disminuye, no desaparece en su totalidad. De hecho, gracias a este acoplamiento se observan efectos como el NOE. El efecto NOE se debe a la relajación cruzada debida a la interacción dipolar del campo fluctuante de un núcleo con los espines cercanos al mismo253. Este acoplamiento dipolar residual en disolución proporciona información
estructural intrínseca del sistema60.
Si una molécula posee alta anisotropía magnética, bien debido a que su tensor de rotación es no isotrópico, bien a la introducción de elementos que provoquen esta anisotropía (ver más adelante), no sólo sus núcleos, sino la molécula misma se orienta en presencia de ese campo magnético. Como resultado, no todos los dipolos muestran la misma orientación entre sí y con
respecto al campo magnético externo. En consecuencia, habrá una diferencia en la magnitud del acoplamiento dipolar entre los núcleos en función de cómo estén orientados éstos respecto al tensor de anisotropía magnética. Supongamos dos pares de núcleos 15N-1H situados en posiciones
diferentes de una proteína (Figura 21). Suponemos, también, que estos dos pares 15N-1H están en
zonas rígidas de la molécula, es decir, que giran con la rotación de ella, esto es, ambos tienen τc=τr
(Capítulo 2 de la Introducción). Si la molécula gira rápidamente y/o de forma isotrópica, el acoplamiento dipolar entre el núcleo de 15N y su protón unido será el mismo para los dos N-H,
independientemente de la posición de estos pares en la molécula. Sin embargo, si la molécula se orienta de una forma determinada respecto al campo magnético, el acoplamiento dipolar entre estos núcleos dependerá de cómo se orienten ellos respecto al tensor de anisotropía magnética molecular. Cada par de núcleos presentará un acoplamiento distinto en cada una de las moléculas. La rotación en estos sistemas no promedia los acoplamientos dipolares. Las diferencias en estos acoplamientos se deben a una orientación determinada. En consecuencia, la medida de estas diferencias (rdc) proporciona información sobre la orientación de los dipolos con respecto al tensor de anisotropía magnética del sistema. Esta información es independiente de la distancia a un sistema de referencia y puede, lógicamente, utilizarse en la resolución de estructuras de proteínas. Ha sido ampliamente aplicada en el refinamiento de estructuras previamente resueltas147,445,446 y en la determinación de la
orientación relativa entre dominios existentes de una misma proteína146,461,462.
La variación de los acoplamientos dipolares en función de la orientación de los dipolos respecto al tensor de anisotropía magnética se manifiesta en los parámetros de RMN. De entre todos ellos, las constantes de acoplamiento heteronucleares a un solo enlace, 1JHX, son, con toda seguridad, los
parámetros experimentales de RMN más simples de analizar. Más concretamente, las constantes 1JHN
sólo dependen de la distancia 1H-15N, 1.02 Å, constante para todos los pares de una molécula, de la
anisotropía del desplazamiento químico de los núcleos 15N (csa) y de la posible orientación de cada
par 15N-1H con respecto al tensor de anisotropía magnética. Por todo ello, las constantes 1JHN son los
parámetros más extensamente utilizados para medir los rdc60,218,222,444,463-466.
Como acabamos de comentar, para medir los rdc es necesario que la molécula se oriente en un campo magnético (Figura 21). Cuanto mayor sea el campo magnético, tanto mayor será la orientación de la molécula. A pesar de todo, estos efectos sólo se han podido estudiar en la práctica con el desarrollo de los espectrómetros de campo alto (600 MHz o más)444. No obstante, la
orientación que produce en las moléculas un campo alto no es, en muchas ocasiones, suficiente para obtener valores de rdc significativos y que proporcionen restricciones en el cálculo estructural. Por ello se recurre a diversos métodos que orientan las moléculas en disolución; entre ellos podemos destacar: el uso de bicelas fosfolipídicas467, de fagos filamentosos466, de geles de poliacrilamida o
también fragmentos de membrana de bacterias como la membrana púrpura de Halobacterium salinarum468,469 y virus470. Nosotros en esta Tesis hemos empleado un m étodo diferente: el uso de
iones metálicos paramagnéticos, concretamente iones lantánidos, para producir la orientación de la molécula. En el uso de este método han sido pioneros el Prof. J. H. Prestegard59 (Universidad de
2. Orientación Molecular
Yale, New Haven), Prof. D. Marion145-147 (Instituto de Biología Estructural, Grenoble) y el Prof.
Bertini218,221,471.