6 Case Studies
6.2 The e-purse Scenario
b.1) Constantes de acoplamiento
Calculamos las constantes de acoplamiento 3JHNHα a partir de las relaciones obtenidas
entre la intensidad del pico de la diagonal (υ1HN, υ2N, υ3HN) y la del pico de cruce (υ1Hα, υ2N, υ3HN)
tras integrar de 3 a 5 planos 1H-1H del experimento HNHA441. Las constantes de acoplamiento se
convertían en restricciones de los ángulos de torsión φ del esqueleto utilizando las curvas de Karplus adecuadas46. Los ángulos obtenidos se introducían en el programa de cálculo con un error
de ± 10º, salvo en el caso de ocho ángulos en los que el intervalo de error se estableció en ± 20º. Cuando para un valor de las constantes de acoplamiento eran posibles varias soluciones de las ecuaciones de Karplus, elegíamos el ángulo diedro consistente con las estructuras calculadas sin esa restricción.
Obtuvimos los ángulos diedros ψ a partir de la relación IHNHα/IHNHα-1, obtenida tras la
integración del experimento 15N NOESY-HSQC449. El término IHNHα corresponde a la intesidad, en el
NOESY, del pico de cruce del protón amídico y el protón-α del mismo residuo, mientras que el término IHNHα-1 corresponde a la intensidad del pico del mismo protón amídico con el protón-α del
residuo precedente. Cuando el valor de esta relación era mayor de 2.0, el ángulo ψ se fijaba en el intervalo de –65º a +5º para todos los aminoácidos excepto para Ile, Thr y Ala. Para estos aminoácidos se estrechaba el intervalo entre –65º y –15º. Si la relación era menor que 1.0, se
3. Determinación Estructural
consideraba que el valor de ψ estaba comprendido en el intervalo de 100º a 170º para todos los aminoácidos.
Utilizamos los valores de 3JHNHβ para realizar la asignación estereoespecífica de los
protones metilénicos. Estas constantes de acoplamiento se obtenían a partir de la intensidad relativa de los dos picos de cruce HN-Hβ del experimento tridimensional HNHB436.
b.2) Puentes de hidrógeno
Hemos determinado los puentes de hidrógeno de manera directa utilizando un experimento HNCO bidimensional con un inept de 15N-13C donde el tiempo de transferencia era 66
ms (apartado 2.3). Este tiempo optimiza la transferencia de la coherencia entre un protón amídico y un grupo carbonílico que estén formando un puente de hidrógeno.
Las constantes de acoplamiento 3hJN-CO observadas se pueden traducir en restricciones
del cálculo de estructuras en límites superiores de distancias N...O. Así mismo, para mantener la
linealidad del enlace también se introducían límites inferiores a las distancias N...O y H...O.
Concretamente, cuando se observaba un puente de hidrógeno en el experimento HNCO específico para su detección442 (apartado 2.3) se introducían las siguientes restricciones:
rH· · · O < 2.2 Å y 2.6 Å < rN· · · O < 3.3 Å
donde rH· · · O y rN· · · O son las distancias del oxígeno al protón amida y al nitrógeno, respectivamente,
en los puentes de hidrógeno formados. Los límites de distancia inferiores están restringidos a mantener la linealidad del puente de hidrógeno.
3.4.
3.4.
Cálculo de Estructuras Cálculo de Estructuras
El programa utilizado para el cálculo de la estructura del derivado de cerio(III) de la calbindina D9k era una versión modificada del programa DYANA143, llamado PSEUDYANA144, que permite el uso
de pcs como restricciones. El programa utiliza la dinámica de torsión de ángulos, TAD (Torsion Angle Dynamics) y el algoritmo simulated annealing. Se calculaba una familia de 200 estructuras partiendo de confórmeros generados al azar en 10000 pasos de annealing. La calidad de las estructuras calculadas por PSEUDYANA se estimaba mediante una función definida adecuadamente mediante la función diana que es proporcional al cuadrado de las desviaciones de las restricciones calculadas respecto a las experimentales. En el programa DYANA (y también en PSEUDYANA) la función diana tiene el papel de energía potencial. La función diana tiene dimensiones de longitud al cuadrado (sus valores se expresan en Å2). La familia de estructuras elegida estaba formada por los 30 confórmeros
Los parámetros utilizados para el cálculo de la estructura de CaCeCb parcialmente desnaturalizada (Capítulo 6 de Resultados) fueron los mismos que los descritos anteriormente. El programa utilizado para estos cálculos fue la nueva versión PARAMAGNETIC-DYANA221.
Para analizar las estructuras calculadas hemos utilizado los programas RASMOL516, MOLMOL517
y PROCHECK-NMR518.
4. Dinámica de Proteínas
4
4
4
4....
DDDDiiiinnnnáááámmmmiiiiccccaaaa ddddeeee pppprrrrooootttteeeeíííínnnnaaaassss
4.1.
4.1.
Cálculo de RCálculo de R
11y R y R
22de de
1515N y de NOE N y de NOE
11HH --
1515NN
Las intensidades de los picos cruzados se extraían de los experimentos bidimensionales (apartado 2.5). Los valores de las velocidades de relajación longitudinal y transversal, R1 y R2,
respectivamente, de 15N se determinaron mediante el ajuste de las intensidades de una señal en la
serie de experimentos, a la ecuación:
II( )tt
=II
∞+(II
0−II
∞)expexp(−tRtR
1,,2)
[37] donde t representa el tiempo de recuperación con dos parámetros de ajuste independientes, R1,2; I0 representa la intensidad de la señal para un tiempo t = 0 s. El parámetro I0 se ajustaba a 0 para las medidas de relajación transversal, R2. Las incertidumbres en los valores de R1 y R2 se obtienenmediante el protocolo Monte Carlo480.
Los valores de los NOEs de 1H-15N se determinaban mediante la razón que existe entre la
intensidad del pico cruzado en el experimento realizado saturando el 1H, Isat, y el realizado sin
saturar, Iinsat (apartado 2.5):
NOENOE
=II
satsat//II
insatinsat [38]Se realizaban tres experimentos sin saturar los protones amida. Cada uno de los NOEs se calculaba a partir de la media de los valores obtenidos en los tres experimentos. De esta forma se obtenían valores fiables de cada NOE. Considerábamos los errores tres veces la desviación estándar,
4.2.
4.2.
Análisis Model --freeAnálisis Model
free
El análisis model-free lo utilizamos para el estudio de la movilidad de la rusticianina (Capítulo 4 de Resultados).
Realizábamos el análisis del movimiento rotacional de toda la proteína a partir de las relaciones
R2/R1 de cada par N-H mediante el programa Quadric Difusión519, versión 1.11. En estos cálculos
utilizábamos la estructura media (minimizada previamente) de la familia de estructuras de la rusticianina (fichero 1CUR.pdb370). Los valores de R2/R1 que eran superiores a la media en una
cantidad mayor al doble de la desviación estándar, los eliminábamos520. Repetíamos este proceso
hasta que todos los valores caían dentro del intervalo de la media + 2σ. Este mismo criterio era el que seguíamos para discernir qué datos se desviaban o no de la media. Así, hemos podido discriminar los pares N-H con un comportamiento dinámico individual de los que seguían el mismo patrón global de toda la estructura de la proteína. Probamos los parámetros de difusión correspondientes a los modelos isotrópico, axial simétrico y completamente anisotrópico476,480.
Utilizamos el factor F 481,482 para comprobar la mejora estadística de ajuste de cada modelo.
Se analizaron los datos de relajación (R1, R2 y NOE 1H-15N) de acuerdo con el protocolo model-
free de Lipari y Szabo478,479 (apartado 3.2), utilizando el programa Modelfree476, versión 4.0. La
función de densidad espectral, J(ω), viene dada por la ecuación 31. Si la suma de los errores de los cuadrados (sum of squared errors, SSE) era menor de 10 para el Modelo 1, tomábamos éste como correcto para los pares N-H correspondientes. Para valores de SSE mayores, se aplicaban los Modelos 2 y 3 y se asumían como correctos si SSE < 10. Sólo se eligió el Modelo 4 para un residuo (Leu46, Capítulo 4 de Resultados).
4.3.
4.3.
Dinámica Lenta de Proteínas Dinámica Lenta de Proteínas
El valor de R2 a un τcp determinado se obtenía mediante el ajuste a dos parámetros (I0, R2) de
las intensidades de los picos obtenidos, I(t), mediante la secuencia de pulsos CPMG (apartado 2.5) de acuerdo con la siguiente ecuación:
II((tt))=II
0exp(exp(−tRtR
2))
[39]donde I0 es la intensidad a tiempo cero (intensidad de los picos en el experimento de referencia, secuencia de pulsos de la Figura 31, pero omitiendo los tiempos y pulsos que en esa Figura se encuentran dentro de los paréntesis). El tiempo t se elegía igual a 4n ×· τcp. Para cada valor de τcp se
modificaba n, tal que el tiempo t variaba entre el mínimo valor posible (4· τcp, típicamente 4-20 ms) y
4. Dinámica de Proteínas
De esta forma obteníamos las curvas de dispersión R2(1/τcp). Hemos calculado los valores de R2
para cuatro valores de τcp diferentes: 1.0 ms, 6.6 ms, 21.5 ms, 64.5 ms. Los valores de R2 obtenidos
para cada uno de los residuos se representan en función de la inversa de 1/τcp. Cuando no se
observaba dependencia de los valores de velocidad de relajación transversal con el período entre pulsos de 180º en la secuencia CPMG, significaba que el aminoácido no está sujeto a procesos de intercambio químico.
Estos cálculos se realizaron para el derivado CaCaCb parcialmente desnaturalizado (Capítulo 6 de Resultados).
4.4.
4.4.
Velocidades de Correlación CruzadaVelocidades de Correlación Cruzada
Obteníamos las velocidades de correlación cruzada, ccr, entre la interacción dipolar de los núcleos 15N y 1H y la anisotropía del desplazamiento químico, csa, de los núcleos 15N, mediante la
expresión: