La sustitución metálica en metaloproteínas es una estrategia habitual en Química Bioinorgánica, en la investigación de estructuras y reactividad de sitios activos para ampliar el abanico de técnicas espectroscópicas con las que estudiar estas metaloproteínas103,375,376. Como
previamente se ha considerado377, podríamos decir que la sustitución metálica es una mutación de la
proteína. Se trata de un método útil para explorar la estructura, función y propiedades físico/químicas del metal y del resto de la molécula. El cambio del ion metálico nos permite, también, obtener conclusiones acerca del papel que desempeña la metaloproteína en el sistema biológico. Si el metal realiza una función estructural, la estabilidad de la metaloproteína se verá afectada por el cambio. El cambio del ion metálico lleva a la variación (en general disminución, aunque a veces, incremento) de la actividad catalítica en la mayoría de los enzimas103,172,375. El estudio de las
propiedades cinéticas en estos metaloderivados se puede utilizar para elucidar detalles del mecanismo del enzima nativo.
En las proteínas de cobre este ion metálico ha sido sustituido por cobalto, níquel, manganeso, mercurio y cadmio, entre otros107. El estudio de estas metaloproteínas derivadas es
importante para la elucidación de la estructura tanto electrónica como molecular del sitio metálico. Las BCPs son proteínas extraordinariamente rígidas261 (Capítulo 4 de Resultados). El cambio del
metal produce sólo mínimas variaciones en el entorno de coordinación del ion metálico. Sólo se ha resuelto la estructura tridimensional de tres derivados metalosustituidos de BCPs, Co(II)Az378,
Ni(II)Az379 y Hg(II)Pc380. En estas estructuras el ion metálico presenta la misma geometría de
coordinación que el ion nativo. En el caso de CoAz existe un pequeño desplazamiento del ion metálico hacia el oxígeno carbonílico de Gly45 axial (en Co(II)Az las distancias Co-OGly45 y Co- SδMet121 son 2.21 y 3.56 Å respectivamente)378 (Tabla 4). El mismo efecto se observa en la NiAz:
3. Proteínas Azules de Cobre: Rusticianina
se alarga hasta 3.30 Å379. Los resultados presentados en estos sistemas metalosustituidos de BCPs
son, por lo tanto, completamente trasladables al sistema nativo, como ha quedado refrendado en numerosos trabajos185,187,188,191,192,195,197,230,245,246,349,377,381-383.
El cobalto(II) es la sonda espectroscópica que más información ha aportado al conocimiento del entorno metálico de las BCPs mediante RMN. Como hemos comentado (apartado 2.2) los espectros de RMN de 1H de las BCPs metaladas con cobalto(II) se caracterizan por una gran
dispersión de sus señales, mucho mayor que en otros sistemas (incluido las proteínas nativas oxidadas, Cu(II)BCPs). Esta propiedad ha permitido caracterizar detalladamente, no sólo la esfera directa de coordinación sino también el entorno del ion metálico. Conviene resaltar que estos estudios se realizan en disolución y que la sensibilidad de los parámetros de RMN a pequeños cambios estructurales es, en estos sistemas, mayor que la observada mediante difracción de rayos X. Un ejemplo de esta afirmación, las conformaciones posibles de Ile140 en la rusticianina, se discute en la presente Tesis (Capítulo 1 de Resultados).
La información deducida a partir de este tipo de experimentos sobre la estructura y función de las BCPs es numerosa. Podemos destacar:
- Determinación de la velocidad de transferencia del protón de la histidina más expuesta al
disolvente. La autotransferencia electrónica se produce, según se había propuesto, a través de esta histidina384. Para que ello fuera posible, la velocidad de transferencia electrónica debería
ser superior al tiempo de permanencia del protón HNε2 en la histidina (este protón intercambia con el agua). Las medidas de velocidad de cambio de este protón con el disolvente demostraron que ambos hechos eran compatibles377.
- Determinación del aminoácido responsable del cambio conformacional y del potencial redox de
azurina con el pH. El potencial redox de la azurina, como el de la mayoría de las BCPs, varía con el pH. Los espectros de CoAz mostraron las sutiles variaciones en torno al ion metálico, paralelas al cambio del potencial redox188,189. A partir de estos estudios también se demostró
que la protonación/desprotonación de la His35, una histidina no coordinada al metal situada a unos 6 Å y que forma enlace de hidrógeno con el oxígeno carbonílico de Met44, es la responsable de los pequeños cambios conformacionales y del potencial redox con el pH191.
- Covalencia del enlace metal-azufre de metionina y metal-oxígeno de glicina en azurina. La
distancia existente entre el metal y estos dos ligandos (3.26 y 2.72 Å, Tabla 4) ha llevado a discusión la covalencia de ambos enlaces. La observación de desplazamiento hiperfino para estas señales230 confirma que el metal está enlazado a ambos átomos covalentemente.
Estudios análogos192-194,245,246,382 confirman este hecho en otras BCPs como se demostrará
más adelante en la presente Tesis (Capítulo 1 de Resultados).
- Grado de covalencia de los azufres de cisteína y metionina al metal. A partir de los
desplazamientos hiperfinos de estas señales se ha elucidado la diferente fuerza de enlace entre el cobalto y estos átomos dadores (uniones decisivas en la termodinámica y cinética de
estas proteínas) para diferentes BCPs172,191,230,245,246,385. Estos datos son trasladables199,373 al
sistema nativo (Capítulos 1 y 2 de Resultados).
- Existencia de un enlace de hidrógeno entre el Sγ de la cisteína coordinada al metal y el protón
peptídico del aminoácido posterior a la HisN coordinada. En todas las estructuras de las BCPs resueltas, el nitrógeno peptídico del aminoácido posterior a la primera de las histidinas coordinadas al metal y el Sγ de cisteína se encuentran lo suficientemente cerca para que formen enlace de hidrógeno. No obstante, por difracción de rayos X no se observan los protones. Mediante RMN de paramagnéticos aplicada a CoAz se observó que tanto el protón peptídico como el protón-α de la Asn47 (aminoácido posterior a la His46, HisN en Az) poseían contribución de contacto230,377.
- Elucidación del ligando axial y de su átomo dador unido al metal en estelacianina. La
estelacianina es una BCP que posee una glutamina en la posición equivalente a la metionina axial en su estructura primaria309. Debido a esto, se suponía que esta glutamina era el ligando
axial del cobre en St. La confirmación de este hecho provino de estudios de CoSt mediante RMN de paramagnéticos192,245. Así mismo, se dedujo que la unión debía producirse por el
oxígeno Oε de la cadena lateral de la glutamina (existían dudas de si la unión se produciría por el oxígeno o por el nitrógeno). La resolución de la estructura terciaria de St por difracción de rayos X305 confirmó esta forma de unión.
La sustitución del Cu(II) por Ni(II) en BCPs proporciona menor desplazamiento de pseudocontacto que el Co(II), pues este ion metálico posee menor anisotropía magnética172.
Además, el Ni(II) posee menos afinidad que el Co(II) por los sitios metálicos de las BCPs. Por estos dos motivos se ha utilizado menos que el Co(II) como sonda espectroscópica en BCPs.
El cambio de cobre por níquel en BCPs se ha realizado con éxito en Az187,188,190,195,197,230,377,383,385 en St194 y PsAz. El hecho de que este derivado posea una anisotropía
magnética casi despreciable permitió afirmar que el desplazamiento hiperfino observado para los protones de NiAz correspondía a la contribución de contacto. Esta contribución era muy alta para los Hγ de la metionina axial, lo que supuso una prueba experimental de la existencia de enlace covalente entre el metal y este aminoácido.
Otras informaciones también deducidas en NiAz (observadas paralelamente en CoAz) son el cambio conformacional con el pH de Az y la velocidad de transferencia de canje de HisC en Az.
Así mismo, también se han utilizado otros núcleos en RMN como sondas espectroscópicas, pero no observando los protones sino el núcleo mismo. Caben destacar el cadmio-113 y el mercurio-199. El cadmio(II) presenta un isótopo estable activo en RMN. La sustitución del Cu(II) por Cd(II) ha permitido obtener información adicional del centro activo de las BCPs mediante espectroscopía de RMN 113Cd386,387. Los desplazamientos químicos del 113Cd son muy sensibles a la
3. Proteínas Azules de Cobre: Rusticianina
naturaleza de los átomos dadores. Las asignaciones de las señales 1H de la Cu(I)- y Cd(II)-
plastocianina evidencian ligeros cambios estructurales debidos a la sustitución metálica387.
El mercurio(II) es también un ion metálico diamagnético, sin embargo el 199Hg es activo al
RMN. Los desplazamientos químicos de 199Hg son muy sensibles a los cambios en la esfera de
coordinación del metal388. Esta sensibilidad se ha empleado para estudiar los centros activos de
distintas BCPs389,390. Las señales de 199Hg en BCPs tienen valores de T1, un orden de magnitud
menor que el 113Cd en el mismo sitio activo. Esto supone otra ventaja del mercurio(II) respecto al
cadmio(II) puesto que a la mayor sensibilidad de las señales hay que añadir la mayor rapidez en la adquisición de los espectros de RMN389,390.
4
4
4
4....
PPPPrrrrooootttteeeeíííínnnnaaaassss qqqquuuueeee uuuunnnneeeennnn CCCCaaaallllcccciiiioooo::::
C
C
C
Caaaallllbbbbiiiinnnnddddiiiinnnnaaaa DDDD9999kkkk
4.1.
4.1.
El Calcio en Sistemas Biológicos El Calcio en Sistemas Biológicos
El calcio participa en gran número de funciones fisiológicas; tantas, que sería prácticamente imposible describirlas todas en una sucinta introducción como la que aquí presentamos. En este capítulo pretendemos dar una visión general del papel del calcio en sistemas vivos. No profundizaremos en el tema puesto que queda fuera del objetivo de esta Tesis.
De entre los procesos biológicos en los que participa el calcio podemos destacar: i) controla la estabilidad mecánica de paredes y membranas celulares y de la tensión en toda la variedad de filamentos presentes en las células257,391,392; ii) forma parte, como constituyente esencial, de los
biominerales formados por sales de calcio como carbonatos, fosfatos y oxalatos (estos biominerales son, a su vez, los constituyentes básicos de los esqueletos de animales y paredes celulares en las plantas); iii) controla también el metabolismo en procesos como el acoplamiento del dioxígeno al proceso de fotosíntesis, el control de deshidrogenasas en la fosforilación oxidativa, reacciones quinasa, etc; iv) la matriz extracelular y sus actividades son calcio-dependientes en los organismos mutlicelulares.
El calcio presenta dos características que le confieren una química de coordinación muy selectiva. Por una parte, puede interaccionar bien con oxígenos dadores neutros, como son carbonilos y éteres, o bien con aniones. Por otro lado, este ion metálico posee además la capacidad de coordinar un gran número de átomos dadores al mismo tiempo. Los grupos que actúan típicamente como ligandos del calcio son ligandos oxígeno dadores, fundamentalmente carbonilos y carboxilatos235.
Debido a la gran diversidad de proteínas de calcio existentes, resulta muy difícil realizar una clasificación. Como en la presente Tesis realizamos el estudio de una proteína de calcio bajo un punto de vista estructural, presentamos aquí una clasificación de estas proteínas basándonos en los tres tipos diferentes de estructuras del centro activo que se pueden encontrar257:
4. Proteínas que unen Calcio: Calbindina D9k
• Centros de calcio con átomos dador es de aminoácidos próximos en la secuencia.Centros de calcio con átomos dadores de aminoácidos próximos en la secuencia. En la apo- proteína estos centros metálicos suelen ser regiones muy móviles pues existe una gran repulsión electrostática debido a la carga negativa. Este tipo de centros coordinan calcio con mucha rapidez. La estructura terciaria de la proteína se reajusta, teniendo lugar sólo modificaciones locales, pero no globales, tras la coordinación del ion metálico. Podemos encontrar este tipo de centro en la calmodulina y en la mayoría de las proteínas intracelulares reguladoras de calcio. La calbindina presenta dos centros de coordinación de calcio de este tipo392.
• Centros de calcio con átomos dadores de aminoácidos no contiguos en la secuencia.Centros de calcio con átomos dadores de aminoácidos no contiguos en la secuencia. La estructura tridimensional en estas proteínas genera una cavidad bastante rígida donde se aloja el calcio. La unión de éste es, pues, muy dependiente del plegamiento de la cadena polipeptídica. La velocidad de coordinación del Ca(II) en estos sitios es menor que en el grupo anterior. Estas cavidades rígidas y bien definidas no sufren prácticamente ningún cambio conformacional tras la coordinación del ion metálico. Un ejemplo de proteína que presenta este tipo de centro para el calcio es la fosfolipasa A2393, también se da en otras proteínas
extracelulares como la nucleasa stafilococal394 y en uno de los centros de la termolisina395.
• Centros de calcio aniónicos o canales.Centros de calcio aniónicos o canales. El tercer tipo de unión del ion calcio está formado por una larga serie de aniones que se encuentran normalmente en la superficie de polímeros al azar. A través de estos aniones, que sobresalen de la estructura de la proteína, el calcio puede viajar rápidamente. Este tipo de coordinación se encuentra, por ejemplo, en algunas fosfoproteínas396,
en glicoproteínas aniónicas del tejido conectivo397 y en el γ-carboxiglutamato que contienen los
péptidos de protrombina398 y de la proteína de los huesos, osteocalcina399.
Desde el punto de vista funcional, se han realizado diferentes tipos de clasificaciones, no todas ellas consistentes entre sí257,392. No obstante, sí hay una amplia clase de estas proteínas que se
engloban siempre bajo el epígrafe de Proteínas Activadoras de Calcio y que son especialmente relevantes en esta Tesis puesto que la calbindina D9K pertenece a este tipo. Estas proteínas se suelen
llamar también calmodulinas por ser ésta la proteína activadora de calcio que más se ha estudiado.
4.2.
4.2.
Proteínas Activadoras de Calcio Proteínas Activadoras de Calcio
a) Características generales
En el interior celular existe una gran variedad de proteínas que coordinan Ca(II). Algunas presentan una rápida respuesta al calcio: la calmodulina o la troponina, mientras que otras, como las calbindinas, la familia S-100 y la familia annexina, presentan una velocidad de coordinación de calcio
mucho menor391,392. Estas proteínas son las responsables de que las células presenten una
respuesta diferente ante la presencia de Ca(II) en el medio. En la Tabla 5 se citan algunas de ellas, así como la función que realizan.
T a b l a 5 .
T a b l a 5 . Algunas proteínas intracelulares que ligan calcio. Se muestran también las proteínas y/o funciones en
las que generan respuesta257.