Extending the control loops

• Para el establecimiento de cultivos de raíces normales de B. candida en biorreactor, se sugiere emplear inóculos que correspondan a radículas de 1,5 a 2 cm, obtenidas a partir de embriones cultivados sobre medio sólido durante 30 días. Éstas son las que presentaron un mayor potencial para generar biomasa y producir alcaloides.

• No se recomienda la aplicación de ANA al medio de cultivo sólido para la germinación los embriones, que dan lugar al inóculo. Lo cual se debe a que la adición de esta hormona a concentraciones de 1, 2 y 3 ppm, induce la dediferenciación de las raíces facilitando la producción de células no diferenciadas.

• Las raíces normales de Brugmansia candida, estudiadas a través de la cinética de crecimiento, presentaron entre ellas un comportamiento similar en cuanto a la producción de anisodamina y escopolamina, observándose un pico de concentración intracelular de estos alcaloides entre los días 10 y 20 de cultivo. Al final de la fase de crecimiento, se observa un detrimento en dichas concentraciones, razón por la cual se sugiere como tiempo de cultivo 20 días.

• Para las raíces transformadas de Brugmansia candida clon Arg3, el perfil de alcaloides obtenido es similar al que presentan las raíces normales, sólo que la máxima concentración de escopolamina y anisodamina se produce al día 25, luego del cual se inicia su detrimento.

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• Para determinar de manera indirecta el crecimiento de las raíces de B. candida normales y transformadas, se pueden establecer relaciones con la concentración de azúcares en el medio de cultivo y con la conductividad del mismo, obteniéndose buenos índices de correlación.

• Para el cultivo de raíces normales de B. candida en un biorreactor dual, con aireación en la unidad de crecimiento, se alcanzó un IC de 1,58, y una concentración de escopolamina intracelular de 0,73 mg/g de RF. Valores comparables a los obtenidos por las raíces cuando fueron cultivadas en Erlenmeyer, que indica que el cambio de escala no afectó el potencial de las raíces para generar biomasa y producir los alcaloides estudiados.

• En el cultivo de raíces normales de B. candida en un biorreactor dual, con aireación en la unidad denominada reservorio, en donde se alcanzó un IC de 0,7, y una concentración de escopolamina intracelular de 0,42 mg/g de RF, se observó un rendimiento más bajo comparado con obtenido por medio de la otra configuración probada. Este fenómeno puede explicarse como consecuencia de la aspersión más fina del medio sobre las raíces que se logra cuando el aire se usa para impulsar el medio dentro de la unidad de crecimiento, pues este factor hace que las raíces mantengan un contacto más intimo con él, mejorando los procesos de transferencia de masa y por ende el desarrollo de las raíces.

• De observar el consumo de azúcares, para el caso de las raíces normales de Brugmansia candida cultivadas en Erlenmeyer, en donde se realizó cromatografía líquida identificando sacarosa, glucosa y fructosa, se puede decir que en estos cultivos, la sacarosa es hidrolizada a glucosa y fructosa,

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y que de estos dos azúcares la glucosa es consumida preferencialmente por las raíces sin que llegue a agotarse durante el tiempo de estudio.

• Otro factor que puede contribuir a las diferencias que se presentan en los dos tipos de sistemas evaluados para el cultivo de las raíces normales puede estar relacionado con el intercambio de gases dentro de la unidad de crecimiento, no solo de oxígeno, sino también de dióxido de carbono y etileno, que igualmente afectan el desarrollo de las raíces y la producción de metabolitos. Pues cuando el aire se alimenta directamente a la unidad de crecimiento, es posible que este desplace los demás gases presentes en la unidad a una velocidad mayor que cuando el aire se suministra en la unidad denominada reservorio.

• Se establece que existen diferencias en el perfil de los alcaloides para clones correspondientes a raíces transformadas de B. candida, que provienen de plantas de la misma especie con diferente origen geográfico.

• De los clones transformados obtenidos, se puede decir que aquellos que provienen de una planta cultivada en Argentina (Arg1, Arg2, Arg3 y Arg4), presentan un mayor contenido de anisodamina e hiosciamina que los clones obtenidos a partir de una planta cultivada en Colombia (Col1, Col3, Col5 y Col6). Sin embargo, los clones originados a partir de esta última, tienen una mayor capacidad para producir escopolamina.

• Se observó por primera vez en una investigación de este tipo, trabajando en paralelo con raíces normales y transformadas, que la transformación genética de la Brugmansia candida con Agrobacterium rhizogenes, afectó negativamente la producción de escopolamina en las raíces de origen colombiano.

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• Cuando las raíces transformadas de B. candida, crecieron en cultivo sumergido en biorreactor, su IC fue muy similar al obtenido cuando las mismas se desarrollaron en Erlenmeyer de 125 ml, concluyendo para este caso que el cambio de escala no afecta de manera significativa la producción de biomasa.

• La situación observada para las raíces transformadas que crecieron en el biorreactor dual, permitió concluir que este sistema no era el más adecuado, puesto que las raíces no crecieron a la misma velocidad que crecían en Erlenmeyer, o, en el cultivo sumergido desarrollado en biorreactor.

• De otro lado, el cultivo de raíces transformadas de B. candida, permite alcanzar velocidades mayores de generación de biomasa comparado con el cultivo de raíces normales, que combinadas con las potencialidades de la especie para la producción de alcaloides pueden convertirse en una herramienta clave para una producción masiva de los alcaloides del tropano.

• Comparando con estudios previos, sobre la producción de anisodamina, se puede concluir que el cultivo de raíces normales y transformadas de B. candida en biorreactor, se presenta como una alternativa promisoria para el escalado de su producción al nivel industrial.

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