Feature extraction and Support Vector Machine classification

Información relativa al ensayo:

El inóculo que se colocó en la unidad de crecimiento, consistió en raíces obtenidas a partir de embriones, cultivadas durante 30 días sobre medio sólido (B5 + 20 g/l de sacarosa + 10 g/l de Agar pH: 5.8).

Las demás condiciones usadas fueron:

Medio: B5 suplementado con sacarosa 20 g/l. Tamaño de poro de los filtros de aire: 0,22 µm. Otras adiciones al medio:

Ampicilina: 1 g/ 2l de medio.

Nistatina: 1ml/ 2l de medio (de una suspensión 100.000 UI /ml).

pH del medio líquido usado en el cultivo: 5.8 Flujo de Aire: 0,47 l/min (0,24 vvm)

Transferencia de medio:

Se usaron las mismas bombas con igual régimen de flujo que en el ensayo anterior, es decir el medio entraba en la unidad de crecimiento a una velocidad de 0,30 ml/s y salía a 0,39 ml/s, garantizando que no hubiera acumulación en esta unidad.

Muestreo:

Se tomó una muestra de 20 ml de medio de cultivo del tanque reservorio cada 4 días.

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El monitoreo del pH del medio, presentado en la figura 48, se realizó con el electrodo original del reactor Applikon, empleado en este caso como tanque reservorio.

Figura 48. Comportamiento del pH del medio, para los 21 días de cultivo de

raíces normales de B. candida en el sistema de biorreacción de dos unidades, empleando medio B5, temperatura ambiente y condición de oscuridad. Caso 2:

Aireación en la unidad de control de medio.

Igual que en el ensayo anterior se observa una tendencia del pH a disminuir, notándose una variación marcada luego de la adición del sulfato de cobre al día 21 del cultivo.

Así mismo, se realizó el seguimiento del consumo de azúcares durante el crecimiento de las raíces, los resultados se presentan en la figura 49:

5 5,5 6 6,5 7 7,5 0 5 10 15 20 25 pH Tiempo de Cultivo (d)

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Figura 49. Comportamiento del la concentración de azúcares del medio, para los

21 días de cultivo de raíces normales de B. candida en el sistema de biorreacción de dos unidades, empleando medio B5, temperatura ambiente y condición de

oscuridad. Caso 2: Aireación en la unidad de control de medio.

En donde se puede observar que el mayor consumo de azúcares se sucede durante los 12 primeros días del cultivo, después de los cuales, esta variable tiende a estabilizarse. De igual forma a como ocurrió en el caso I.

Crecimiento de las raíces

Respecto al incremento de la biomasa se tiene que:

Peso de raíces inóculo: 10,67 ± 0,1 g.

Peso de raíces al finalizar cultivo: 18,10 ± 1,07 g.

Estos pesos son de raíces frescas.

Índice de Crecimiento alcanzado en el biorreactor

Utilizando los valores promedio de la biomasa al inicio y al final del cultivo se tiene:

𝑰𝑰𝑰𝑰 =(𝟏𝟏𝟏𝟏, 𝟏𝟏 − 𝟏𝟏𝟏𝟏, 𝟑𝟑𝟎𝟎)_{𝟏𝟏𝟏𝟏, 𝟑𝟑𝟎𝟎} IC = 0,7 10 12 14 16 18 20 22 0 5 10 15 20 A zu car es ( g/ L) Tiempo de Cultivo (d)

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En este caso, el índice de crecimiento igual a 0,7, que es inferior al obtenido para las raíces cuando estas crecieron bajo la configuración I del sistema de bioreacción.

En la tabla 9 se presenta el valor correspondiente a la aproximación realizada a la biomasa final, día 21 de cultivo, empleando para el cálculo la relación IC - concentración de azúcar.

Tabla 9.Determinación de la biomasa en el reactor al final de cultivo de acuerdo a

la concentración de azúcar, empleando medio B5, temperatura ambiente y condición de oscuridad. Caso 2: Aireación en la unidad de control de medio.

Relación usada Valor

inicial de la variable Valor final de la variable IC Biomasa final según IC % error* Sacarosa – Biomasa So = 20 g/L S = 11, 44 g/L 1,7 28,8 g 59,2

*El error se calcula respecto al valor real de biomasa al finalizar el cultivo (18,1 g).

En este caso la determinación indirecta de la biomasa a partir de la concentración de azúcares en el medio, presentó una baja aproximación a los resultados reales obtenidos para el crecimiento de las raíces en el biorreactor, Caso II.

Humedad de las raíces:

La humedad de las raíces fue 93,1 ± 0,7 %.

Análisis cuantitativo del metabolito por CLAE:

Puesto que en el ensayo anterior se determinó que la presencia de alcaloides en el medio era despreciable en este ensayo solo se evaluó la escopolamina intracelular, es decir la que se obtuvo por extracción de las raíces.

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La concentración de escopolamina presente en las raíces fue de 6,07 ± 0,41 mg/ g de RS, un valor ligeramente más bajo que el obtenido en la otra configuración del sistema de biorreacción. Por tanto se descarta la configuración en donde el aire se añade a la unidad de reservorio como alternativa para el cultivo de raíces de Brugmansia candida enfocados a la producción de escopolamina.

En la figura 50 se presenta una imagen de las raíces obtenidas al día 21 del cultivo, para el caso II.

Figura 50. Raíces normales de Brugmansia candida producidas en el reactor,

empleando medio B5, temperatura ambiente y condición de oscuridad. Caso 2: Aireación en la unidad de control de medio.

4.2 CRECIMIENTO DE RAÍCES TRANSFORMADAS DE Brugmansia candida

En esta segunda parte del capítulo, se presentarán los resultados correspondientes a los ensayos realizados con raíces transformadas.

El orden en que son presentados es el siguiente: se inicia con los datos de crecimiento de los embriones luego del tratamiento con ácido giberélico. Posteriormente, se presentan los aspectos relacionados a la obtención de los

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diferentes clones de B. candida, es decir los clones procedentes de la especie colombiana y los de origen argentino.

Luego se muestra la caracterización de los clones en cuanto a producción de alcaloides (escopolamina, hiosciamina y anisodamina), y se selecciona un clon, que es el usado para llevar a cabo la curva de crecimiento de biomasa.

Caracterizado el clon, se inician los ensayos en biorreactores, que dan origen a resultados respecto al crecimiento bajo dos condiciones diferentes, el cultivo sumergido y el cultivo en un sistema de dos unidades.

Finalmente, se comparan los resultados obtenidos para establecer algunas conclusiones.

4.2.1 Resultados correspondientes a la germinación de los embriones usados para