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Se ha demostrado previamente que VisH está involucrado en la respuesta de la bacteria a los cambios producidos por IAV en neumocitos (Fig. 14). La carencia de la VisH conlleva a una disminución de la capacidad de neumococo de sobrevivir dentro de células A549; sin embargo, no se conoce el papel que cumple esta quinasa en el desarrollo de autofagia, ya sea en células infectadas solamente con neumococo o durante la coinfección IAV/neumococo.

Para abordar este punto, monocapas de células A549 se infectaron con IAV durante 1 h. Lluego de 1 h adicional de incubación con medio fresco, los cultivos fueron sobreinfectados con la mutante visH durante 1 y 3 hs. Como control, se infectaron cultivos únicamente con visH en ausencia de infección viral, siguiendo el mismo esquema cinético. A continuación, los lisados celulares fueron analizados por Western blot, utilizando anticuerpos anti-LC3 y anti-β-Actina.

69 La infección con visH incrementó los niveles de LC3-II por acumulación de autofagosomas de modo similar a la cepa salvaje, sugiriendo que VisH no está involucrada en los procesos autofágicos desencadenados por la infección con neumococo (Fig. 17 [carril 8]). Sin embargo, en la coinfección con IAV y visH los niveles de LC3-II mostraron un incremento que se mantuvo elevado aún a las 3 h de coinfección, de manera opuesta a lo obtenido con la cepa salvaje de neumococo, sugiriendo que la quinasa visH estaría vinculada con la disminución de los niveles de LC3-II observados en presencia de virus.

Fig. 17. La autofagia está involucrada en el sinergismo entre IAV y S. pneumoniae.

A) Células A549 se incubaron con IAV cepa PR8 por 2 y 5 h (Carriles 2 y 3); con neumococo R801 salvaje por 1 y 3 h (Carriles 4 y 5); VisH por 1 h (Carril 8); o en coinfección durante 1 y 3 h (Carriles 6, 7, 9 y 10). Como control se utilizaron células sin tratamiento (Carril 1), o tratadas con Rapamicina (80ug/mL) para inducir autofagia (Carril 11), o Rapamicina e inhibidores de la fusión lisosoma-autofagosoma: bafilomicina A1 (100 nM) (Carril 12 y 14) y Cloroquina (12,5 uM) (Carriles 13 y 15). Las células se lisaron con RIPA y las muestras fueron analizadas por WB utilizando anticuerpos anti- LC3 y anti-β-Actina. B) Análisis cuantitativo de los niveles de LC3-II. La intensidad de las bandas se cuantificó usando el programa Odyssey-LI-COR. En cada condición se normalizó LC3-II con β-actina y se representó como veces de cambio respecto ala intensidad de banda en la condición Sin Tratamiento (ST). El test estadístico utilizado fue ANOVA de una vía, seguido del Test Post Hoc Dunnett (Grupo control: ST). Las diferencias significativas son indicadas como *p < 0.05; *p < 0.05; ***p<0.001.

A

70

DISCUSIÓN

S. pneumoniae: adaptación al medio ambiente y patogénesis

En humanos, S. pneumoniae coloniza la nasofaringe de manera asintomática. El sistema inmune innato y adaptativo generalmente impiden que la colonización progrese a enfermedad. Sin embargo, frecuentemente las alteraciones en la homeostasis huésped-patógeno conllevan a infecciones que amenazan la vida del hospedador. Por lo tanto, es importante comprender la patogénesis infecciosa de neumococo, para lo cual se debe determinar el rol que desempeñan los factores de virulencia involucrados e identificar posibles puntos de intervención para un tratamiento terapéutico.

Diferentes estudios demuestran que la expresión de los factores de virulencia de neumococo se encuentra estimulada por el ambiente y presenta diversas estrategias de regulación que son de gran importancia para la adaptación a nuevos ambientes (Preston et al., 2008; Mitchell

et al., 2010; Patenge et al., 2013). Durante la colonización e invasión, uno de los mecanismos de adaptación bacteriana a nuevas condiciones ambientales es mediante los sistemas de señalización TCS que responden a estímulos externos (Hoch, 2000; Stock et al., 2000; Hava et al., 2003). En nuestro laboratorio se identificaron y caracterizaron algunos TCS que contribuyen en los procesos de desarrollo de la infección y la virulencia en S. pneumoniae. En particular, se encontró que el sistema MicAB responde a la concentración de oxígeno en el medio, como así también los sistemas CiaRH, ComDE y la serin/treonin quinasa StkP en la inducción del estado de competencia y la virulencia (Echenique et al., 2000; Echenique et al., 2001; Kadioglu et al., 2003; Echenique et al., 2004). Por otro lado, se encontró que el estrés ácido es una condición ambiental capaz de inducir autólisis (ASIL) para asegurar la liberación de ADN, compuestos de la pared celular y factores de virulencia, favoreciendo el intercambio genético y contribuyendo a su patogenia (Pinas et al., 2008). Este mecanismo mediado por el regulador de respuesta ComE, es activado de manera independiente del mecanismo de quorum sensing descrito para la regulación de la competencia, y conlleva a una inducción de lisis bacteriana mediante la autolisina LytA, involucrando en el proceso a StkP (Pinas et al., 2008). Contrariamente, se encontró que CiaRH ejerce un rol protector de la inducción de ASIL (Pinas et al., 2008; Cortes, 2013). En este sentido, CiaRH presenta un papel esencial en la preservación de la integridad bacteriana, a través de la puesta en marcha del mecanismo de tolerancia al estrés ácido (ATR) (Cortes, 2013). Estos hallazgos denotan que neumococo utiliza diferentes mecanismos de señalización que pueden desempeñar un rol distintivo en la patogénesis bacteriana.

Tomando como referencia estos precedentes, surgieron una serie de interrogantes dirigidos por a descifrar el curso intracelular de la infección por neumococo y el papel que cumplen los diferentes mecanismos bacterianos en contexto de relación huésped-patógeno. Por otra parte, el enfoque estuvo también dirigido a esclarecer los eventos celulares y moleculares que forman parte de la sinergia en las etapas iniciales de la coinfección con IAV. Los resultados obtenidos en el presente trabajo aportan evidencias concretas de que neumococo pone en marcha una serie de procesos que le permiten mantener su viabilidad dentro de la célula hospedadora por varias horas, otorgándole un beneficio al proceso infectivo. La infección también dispara el mecanismo de

71 autofagia, que responde en defensa de la propia célula. Asimismo, se demuestra que la bacteria es capaz de percibir cambios intracelulares ocasionados por una infección previa con IAV, confiriéndole una ventaja a nivel de internalización y sobrevida. Estos hallazgos permiten explicar parte de esta interacción biológica compleja que ocasiona altas tasas de morbi-mortalidad a nivel mundial en los pacientes co-infectados con S. pneumoniae e IAV.

Con el fin de dilucidar los mecanismos que S. pneumoniae utiliza para invadir y establecer una infección en el huésped, se desarrolló un modelo de infección in vitro en cultivos de neumocitos A549 y macrófagos RAW264.7, utilizando ensayos de protección con antibióticos y determinando la internalización y sobrevida de neumococo en estas células. Los resultados indicaron que las células RAW264.7 internalizan 50 veces más bacterias que las células A549 (Fig.3A), lo cual se condice con la función fagocítica profesional de los macrófagos, otorgada por la presencia de receptores en la superficie que detectan patrones moleculares característicos de patógenos (PAMPs) (Navarre et al., 2000). Estos receptores se encuentran ausentes en las células epiteliales (Celli et al., 2002; Bartlett et al., 2008). Por otro lado, en ambas líneas celulares se encontró que la sobrevida de las bacterias internalizadas disminuye con el transcurso del tiempo (Fig. 3 B, C). Esto sugiere que podría estar siendo degradada de manera dependiente de lisosomas, a partir del trabajo realizado por Radin et al. (2005), en donde un 50% de las bacterias internalizadas mostraba marca positiva para Lysotracker (marcador del compartimento lisosomal), luego de 3 hs post infección. No obstante, en base a los ensayos de sobrevida, existe una subpoblación de neumococo que permanece viable intracelularmente durante al menos 5 y 6 h en células RAW264.7 y A549, respectivamente (Fig. 3). La relevancia fisiológica de este hallazgo reside en que la viabilidad intracelular significa una ventaja para neumococo en el proceso de infección. En este sentido, algunas bacterias permanecen alojadas varias horas en el interior de células epiteliales para evadir el sistema inmune del huésped (Wu et al., 2011; Coutanceau et al., 2005; Medina et al., 2003; Hornef et al., 2002), mientras que aquellas que sobreviven dentro de macrófagos pueden diseminarse a otros sitios gracias a la capacidad migratoria de estas células (Pei et al., 2014; Kubica

et al., 2008; Moazed et al., 1997). Si bien neumococo permanece varias horas tanto en células A549 como en RAW264.7, el porcentaje de bacterias intracelulares al cabo de 300 min post-infección es aproximadamente un 35 % mayor en células epiteliales (Fig. 3 B, C). Esta diferencia podría estar vinculada con mecanismos degradativos específicos de los macrófagos, como por ejemplo la activación de ROS (Imlay, 2002).

La cuantificación de las UFC provenientes de lisados celulares infectados (Fig. 3B, C), refleja los diferentes procesos intracelulares que acontecen simultáneamente en distintas células del cultivo (replicación intracelular, migración bacteriana hacia el exterior y eliminación por parte del huésped), sin brindar información específica sobre el proceso que experimenta la bacteria en cada célula individualmente. Para diferentes géneros bacterianos, existen evidencias que indican que, luego del evento de invasión, coexisten diversas subpoblaciones de bacterias internalizadas que interaccionan de manera diferente con las vías de tráfico vesicular de la célula hospedadora, resultando en múltiples destinos para el patógeno endocitado. Tal es el caso de Salmonella entérica

(Birmingham et al., 2006; Malik-Kale et al., 2011), Listeria monocytogenes (Birmingham et al., 2008) y Mycobacterium tuberculosis (Simeone et al., 2012). Es posible reconocer diferentes subpoblaciones de S. pneumoniae cohabitando dentro de una misma célula infectada. Por ejemplo, la colocalización parcial con marcadores lisosomales supone un destino degradativo para una

72 subpoblación internalizada a través de PAF-R (Radin et al., 2005) o por pIgR (Asmat et al., 2014). Otra subpoblación de S. pneumoniae aprovecha las vesículas Rab11 para alcanzar nuevamente la superficie celular, o hace uso de la transcitosis en células de la microvasculatura cerebral y de pulmón, logrando escapar por la superficie celular basolateral de cultivos polarizados, sin ocasionar daño a la célula hospedadora (Radin et al., 2005; Ring et al., 1998; LeMessurier et al., 2013; Gradstedt et al., 2013). Esto ocurre posiblemente a través de endocitosis mediada por caveolina, eludiendo la vía canónica endosoma-lisosoma (Doherty et al., 2009; Ueno et al., 2009; Rodriguez et al., 2006; Predescu et al., 2004; Tugizov et al., 2013). En relación a la vía de reciclaje, se conoce que diferentes bacterias utilizan este mecanismo para lograr salir de las células que han infectado, interfiriendo con el tráfico normal de la célula huésped, evitando su detección y degradación (Fredlund et al., 2014; Takeuchi et al., 2011; Barrile et al., 2015). Por consiguiente, la reducción de la cantidad intracelular de neumococo que subsiste luego de la internalización (Fig. 3 B, C), podría deberse a que la bacteria es eliminada dentro la célula huésped o a un escape del patógeno al medio extracelular. En este último caso, la bacteria moriría al entrar en contacto con los antibióticos presentes en el medio de cultivo, por lo que el modelo de infección establecido (Esquema 11) no permite distinguir entre estas dos posibilidades. En este sentido, no se ha reportado que neumococo replique dentro de las células hospedadoras; no obstante, en base al modelo experimental utilizado en este trabajo no se puede descartar tal evento.

También se conoce que ciertas bacterias pueden entrar en un estado viable-no replicante en las células hospedadoras (“persisters”), donde logran sobrevivir a los mecanismos de eliminación de la inmunidad innata y muestran tolerancia a los antibióticos. Algunos ejemplos de tales bacterias incluyen M. tuberculosis (Bermudez et al., 1999), E. coli uropatógena (Mysorekar et al., 2006; Schwartz et al., 2011), Chlamydia pneumoniae (Kern et al., 2009; Buchacher et al., 2014),

Campylobacter jejuni (Watson et al., 2008; Perez-Boto et al., 2012) y Haemophilus influenza (Morey

et al., 2011). En el caso de la infección de macrófagos por Salmonella entérica serovar Typhymurium (S. Typhymurium), se encontró que luego de 2 h de infección la mayoría de las bacterias internalizadas se mantiene en un estado no-replicante, comprobándose que el arresto en el crecimiento es reversible y que la internalización, acidificación y deprivación de nutrientes son inductores de la formación de “persisters” intracelulares (Helaine et al., 2014). Considerando estos antecedentes en relación a otras bacterias, cabe la posibilidad de la existencia de esta tercera subpoblación intracelular de S. pneumoniae. Por esta razón, trabajos posteriores deberán enfocarse en indagar si el estadio intracelular de neumococo en las células hospedadoras (Fig. 3) es un desencadenante en la formación de bacterias persistentes.

Autofagia y sobrevida de neumococo en neumocitos

Luego de la invasión, la autofagia es un componente clave de la inmunidad innata contra infecciones por diferentes microorganismos. Sin embargo, numerosos patógenos desarrollan estrategias para evadir, bloquear o manipular la progresión normal del proceso autofágico y así establecer una infección exitosa y/o persistente (Vazquez et al., 2010; Cemma et al., 2012; Mostowy, 2014). A raíz del desconocimiento del rol de este mecanismo en la infección por neumococo, se analizó la interacción de esta bacteria con la vía autofágica, para indagar acerca de los eventos celulares y moleculares que permiten a esta bacteria establecer una infección. El incremento en los niveles de LC3-II detectado a tan sólo 60 min post-infección indica un aumento

73 en la cantidad de autofagosomas (Fig. 6). Dado que el autofagosoma es una estructura intermedia en una vía dinámica, el número de autofagosomas observados en cualquier punto de tiempo específico es una función del equilibrio entre la tasa de su generación y la tasa de su conversión en autolisosomas. Por lo tanto, la acumulación de autofagosomas puede representar ya sea la inducción de la autofagia, o alternativamente, bloqueo de la degradación corriente abajo de la formación de esta estructura. El flujo autofágico puede ser analizado por Western blot, midiendo el incremento de LC3-II en presencia y ausencia de degradación lisosomal. La inhibición de la degradación lisosomal puede lograrse mediante el uso de inhibidores de proteasas (por ejemplo, leupeptina y E64D) o fármacos tales como bafilomicina que alteran el pH lisosomal o por tratamiento con agentes que bloquean la fusión de autofagosomas con lisosomas. Un incremento en los niveles de LC3-II en presencia de inhibidores de proteasas lisosomales, indicaría un aumento del flujo autofágico. Sin embargo, si el nivel de LC3-II permanece sin cambios, es probable que la acumulación de autofagosomas se produzca debido a una inhibición de la degradación; por ejemplo, por un bloqueo de la fusión autofagosoma-lisosoma. Durante el período de escritura de este trabajo, se describió que S. pneumoniae induce autofagia a través de la via PI3K-I/AKT/mTOR (Li, 2015). Estos hallazgos están de acuerdo con lo observado en la infección de células A549 con la cepa R801 (Fig. 6) y refuerzan la hipótesis de que el mecanismo de autofagia cumpliría un rol citoprotector en la infección por neumococo.

Otro aspecto interesante en este mecanismo es la identificación del evento desencadenante de la respuesta autofágica. En relación a este punto, sería necesario evaluar si la bacteria escapa del fagosoma al citosol, dado que este proceso podría ser una causa que active la autofagia. Al respecto, se ha descripto que neumococo, a través de su hemolisina principal (Ply), desencadena un mecanismo de permeabilización de la membrana lisosomal (LMP) en macrófagos infectados (Bewley et al., 2011; Bewley et al., 2014; Lemon et al., 2015). Además, se conoce que neumococo es capaz de activar los receptores citoplasmáticos Nod2, sugiriendo fuertemente que la bacteria accede al citoplasma de la célula infectada (Opitz et al., 2004; Dorrington et al., 2013; Liu et al., 2014). Sería necesario corroborar si este proceso también ocurre en células epiteliales, y por ende si es la causa de la activación de la autofagia. Estudios dirigidos a elucidar en detalle la biología celular del proceso permitirán una mayor comprensión del impacto de la autofagia en el mecanismo de patogénesis de neumococo.

Internalización y vida intracelular de neumococo

Algunos microorganismos son capaces de establecer un diálogo molecular extraordinariamente sofisticado con la célula huésped, a fin de manipular las vías de transducción de señales y efectuar una serie de eventos que van desde su propia endocitosis hasta la evasión de los mecanismos de degradación (Cossart et al., 2014; Kim et al., 2010). Con el objeto de evaluar qué factores celulares podrían jugar un rol esencial en la patogénesis de la infección, se analizó el efecto del pH de los compartimientos endosomales en relación a la sobrevida o muerte de neumococo. Contrariamente a lo esperado, el tratamiento con inhibidores de la acidificación lisosomal en las células infectadas causó una disminución significativa en la sobrevida intracelular de neumococo (Fig. 4), sin afectar el crecimiento bacteriano in vitro o la viabilidad de las células huésped (Fig. 5). Esto indica que la acidificación es necesaria para la persistencia de neumococo dentro de la célula, posiblemente porque un pH bajo activa ciertos mecanismos o de factores de patogenicidad

74 bacterianos. Diferentes procesos podrían ser desencadenados por el pH ácido; por ejemplo, numerosas toxinas bacterianas requieren de la acidificación para su procesamiento y activación dentro de la célula diana, mientras que su efecto es impedido por el tratamiento con bafilomicina A1 o NH4Cl (Qa'Dan et al., 2000; Barth et al., 2000; McClain et al., 2000). En el caso de Francisella

tularensis la acidez es requerida para liberar el hierro de la transferrina, ya que este metal esencial para su crecimiento (Fortier et al., 1995). El pH ácido es una señal que conduce a S. Typhimurium a una mejor adaptación al entorno intracelular (Foster et al., 1999; Foster, 1999; Bearson et al., 1998; Muller et al., 2009). En este sentido, S. pneumoniae posee mecanismos de resistencia al estrés ácido (ATR), con los cuales puede hacer frente a un descenso en el pH extracelular in vitro (Martin-Galiano

et al., 2005). Investigaciones previas en nuestro grupo de trabajo revelaron el involucramiento de los TCS CiaRH y ComE en el desarrollo in vitro de ATR (Pinas et al., 2008; Cortes, 2013). Mientras que ComE activa el mecanismo de lisis en medio ácido (ASIL), se ha visto que CiaRH ejerce un rol protector frente a este proceso (Pinas et al., 2008). La inducción del mecanismo de ATR, por incubación de cultivos de neumococo en medios de cultivo a pH ácido subletal, demostró que las mutantes ciaR y comE afectan de manera antagónica el desarrollo de ATR. Mientras que en la mutante ciaR se inhibió el mecanismo de tolerancia al pH ácido, comE favoreció su desarrollo, funcionando como un regulador negativo, en favor de la muerte bacteriana (Cortes, 2013). En consecuencia, la inhibición de la acidificación mediante el tratamiento con bafilomicina A1 imposibilita la puesta en marcha de este mecanismo de protección al estrés ácido, lo que permite explicar la disminución en la sobrevida intracelular de neumococo en células que recibieron este tratamiento (Fig. 4). En el presente trabajo se realizaron ensayos in vivo para evaluar si ASIL o ATR están involucrados en la sobrevida o muerte de neumococo dentro de la célula eucariota, dado que la transición de un endosoma temprano a un fagolisosoma es acompañada por una caída del pH por debajo de 5.0, exponiendo a la bacteria a una acidificación gradual (Huotari et al., 2011; Russell

et al., 2006; Gradstedt et al., 2013). La evaluación de la sobrevida intracelular en células A549 mostró que las mutantes ciaR y comE presentan fenotipos opuestos en relación a la viabilidad a lo largo del tiempo (Fig. 8A, B). La ausencia del regulador de respuesta CiaR disminuyó la sobrevida de neumococo dentro de la célula infectada, mientras que la carencia de ComE incrementó el porcentaje de bacterias intracelulares. Esto demuestra que CiaRH y ComE están implicados en los mecanismos bacterianos que determinan su supervivencia (ATR) o suicidio (ASIL), dentro de la célula hospedadora. Más aún, células infectadas con la doble mutante ciaRcomE presentaron el mismo perfil de sobrevida que la simple mutante ciaR (Fig. 10B). Esto demuestra un efecto dominante de CiaRH sobre ComE. El incremento en la sobrevida intracelular que presentó la mutante comE podría estar asociado a un bloqueo en de la autólisis mediada por ASIL. Sin embargo, la infección de las células A549 con la mutante lytA mostró el mismo perfil intracelular que la cepa salvaje (Fig. 10A), indicando que la activación de la autólisis no es el factor de muerte de neumococo dentro de las células. Esto pone en evidencia que el incremento en la sobrevida intracelular observado en la mutante comE se debe a la desinhibición del mecanismo de ATR al eliminarse la regulación negativa de ComE sobre este proceso, y no por un bloqueo de ASIL (Esquema 12).

La identificación de los factores necesarios para la supervivencia intracelular de neumococo permite una valoración de la importancia de las etapas intracelulares en la infección, y también ayuda a comprender las estrategias de persistencia empleadas en los organismos hospedadores. Si bien se determinó que CiaRH y ComE son parte de los mecanismos de respuesta a las condiciones