INFORMATION
11.5 Improvements to access to environmental information which could still be made
S’ han utilitzat dos tipus de sondes loci específiques que són les que normalment s’apliquen de rutina en el diagnòstic citogenètic de determinades síndromes per microdeleció. Aquestes dues sondes han estat l’específica per a la síndrome de Prader-Willi (LSI Síndrome Prader-Willi/Angelman Dual Color probe (SNRPN SpOr/CEP15 SpGr/PML SpOr))(Vysis) i l’específica per a la síndrome de DiGeorge (LSI Síndrome DiGeorge/VCFS Dual color probe (TUPLE1SpectrumOrange/ARSA SpectrumGreen, Vysis).
Les altres sondes específiques han estat per l’estudi de subtelòmers (TelVysion ADN probes, Vysis) i per centròmers (satellite probes, Q-BIOgene).
En general, la metodologia ha estat la que aconsella la casa comercial que bàsicament ha consistit en el següent:
x Envelliment
Abans de procedir a la hibridació s’ha d’envellir la preparació, així aquesta adquireix una major resistència en front els tractaments enzimàtics.
La mostra es pot envellir amb tres mètodes diferents: deixar la preparació durant tres dies a temperatura ambient, a 65ºC o/n o fer un tractament amb 2xSSC a 37ºC durant 30 min.
Una vegada envellit el material, si no es vol continuar amb el protocol seguidament, es pot guardar a –20ºC fins a la seva utilització.
x Postfixació
Es treu la preparació del congelador i es deixa assecar a l’aire durant 1 min. Abans de procedir amb la hibridació es fa un tractament de postfixació.
Es renta el portaobjectes en PBS 1X durant 5 min a temperatura ambient. Seguidament es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% 1 min en cada un i es deixa assecar. Es submergeix la preparació en una solució de pepsina (49,5 ml H2O miliQ, 0,5 ml HCl 1M, 25 Pl de pepsina (100 mg/ml)) a 37ºC durant 5 min. És molt important que la pepsina s’afegeixi just abans de submergir el portaobjectes perquè no es perdi la seva activitat. El temps de tractament amb la pepsina variarà depenent del tipus de mostra i també de la quantitat de citoplasma. Es submergeix en 2xSSC durant 5 min dues vegades seguides, es tracta amb formaldehid durant 2 min (en el cas que el formaldehid no s’hagi fet el mateix dia el temps s’augmentarà 1 o 2 min). Es fan dos rentats amb PBS 1X a temperatura ambient durant 5 min i es deshidrata la preparació en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% 1 min cadascun i es deixa assecar.
_______________________________________________________________________Material i Mètodes
3.6.2- FISH CONVENCIONAL
S’ha aplicat aquesta tècnica per tal de confirmar els resultats obtinguts per altres tècniques citogenètiques. S’han emprat diferents sondes comercials: sondes loci específiques (LSI), centromèriques (CEP), subtelomèriques (subtel) i de pintat cromosòmic (WPC) depenent de l’anomalia cromosòmica analitzada.
3.6.2.1- Sondes lociespecífiques (LSI), centromèriques i subtelomèriques
S’ han utilitzat dos tipus de sondes loci específiques que són les que normalment s’apliquen de rutina en el diagnòstic citogenètic de determinades síndromes per microdeleció. Aquestes dues sondes han estat l’específica per a la síndrome de Prader-Willi (LSI Síndrome Prader-Willi/Angelman Dual Color probe (SNRPN SpOr/CEP15 SpGr/PML SpOr))(Vysis) i l’específica per a la síndrome de DiGeorge (LSI Síndrome DiGeorge/VCFS Dual color probe (TUPLE1SpectrumOrange/ARSA SpectrumGreen, Vysis).
Les altres sondes específiques han estat per l’estudi de subtelòmers (TelVysion ADN probes, Vysis) i per centròmers (satellite probes, Q-BIOgene).
En general, la metodologia ha estat la que aconsella la casa comercial que bàsicament ha consistit en el següent:
x Envelliment
Abans de procedir a la hibridació s’ha d’envellir la preparació, així aquesta adquireix una major resistència en front els tractaments enzimàtics.
La mostra es pot envellir amb tres mètodes diferents: deixar la preparació durant tres dies a temperatura ambient, a 65ºC o/n o fer un tractament amb 2xSSC a 37ºC durant 30 min.
Una vegada envellit el material, si no es vol continuar amb el protocol seguidament, es pot guardar a –20ºC fins a la seva utilització.
x Postfixació
Es treu la preparació del congelador i es deixa assecar a l’aire durant 1 min. Abans de procedir amb la hibridació es fa un tractament de postfixació.
Es renta el portaobjectes en PBS 1X durant 5 min a temperatura ambient. Seguidament es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% 1 min en cada un i es deixa assecar. Es submergeix la preparació en una solució de pepsina (49,5 ml H2O miliQ, 0,5 ml HCl 1M, 25 Pl de pepsina (100 mg/ml)) a 37ºC durant 5 min. És molt important que la pepsina s’afegeixi just abans de submergir el portaobjectes perquè no es perdi la seva activitat. El temps de tractament amb la pepsina variarà depenent del tipus de mostra i també de la quantitat de citoplasma. Es submergeix en 2xSSC durant 5 min dues vegades seguides, es tracta amb formaldehid durant 2 min (en el cas que el formaldehid no s’hagi fet el mateix dia el temps s’augmentarà 1 o 2 min). Es fan dos rentats amb PBS 1X a temperatura ambient durant 5 min i es deshidrata la preparació en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% 1 min cadascun i es deixa assecar.
Material i Mètodes_______________________________________________________________________
- 78 -
x HibridacióLa preparació cromosòmica es desnaturalitza en formamida al 70% a 73º C durant 5 min si prové de sang perifèrica (4 min si prové de líquid amniòtic o cultiu de vellositat corial). Després es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% 1 min en cadascun. Es deixa assecar a temperatura ambient. Mentrestant es barreja la sonda amb aigua miliQ i solució d’hibridació específica per la sonda en les proporcions recomanades per la casa comercial. Es desnaturalitza la barreja a 73ºC durant 5 min. La sonda desnaturalitzada s’aplica sobre el portaobjectes, ja sec, i es cobreix amb un cobreobjectes de 20x20. Es segella amb goma i es deixa hibridar a 37º C o/n en una caixa humida.
x Rentats posthibridació
Es treu el cobreobjectes amb compte i es renta l’excés de sonda i la hibridació inespecífica submergint la preparació en 0,4xSSC/0,3 NP-40 a 73ºC 2 min i s’agita.
Després es renta en 2xSSC/0,1 NP-40 a temperatura ambient. S’afegeixen 10 Pl d’una dilució DAPI ¼ (0,032 ng/Pl) en antifade (Vectashield). Es posa un cobreojectes de 22x22 mm i es guarda a la nevera fins al seu anàlisi.
x Anàlisi
Per capturar la fluorescència de les metafases ben hibridades i per l’anàlisi s’utilitza un microscopi de fluorescència que conté filtres per SpectrumGreen (U-MNIBA), SpectrumOrange
(U-MNG) i DAPI (U-MNU). Segons com estigui marcada la sonda s’utilitza el filtre de
SpectrumGreen i/o SpectrumOrange. Les imatges s’obtenen a través d’una càmara CCD i amb l’ajut d’un software específic (Cytovision, Applied Imaging, Sunderland, UK).
Les imatges corresponents a la fluorescència de DAPI s’inverteixen i serveixen per comprovar en quin cromosoma es troba la senyal de fluorescència.
Per cada cas s’analitzen 8-10 metafases.
3.6.2.2- Tècnica de pintat cromosòmic (WCP)
La tècnica de pintat cromosòmic s’ha emprat per confirmar resultats obtinguts amb altres tècniques citogenètiques.
x Envelliment
Abans de procedir a la hibridació s’ha d’envellir la preparació. Si no es vol continuar amb el protocol en el mateix moment, es pot guardar a –20ºC fins a la seva utilització.
x Postfixació
Es renta la preparació en PBS 1X durant 5 min a temperatura ambient, es deshidrata en etanols 70%, 85% i 100% i es deixa assecar.
x Desnaturalització de la sonda
Es posen 2,5 Pl de la sonda comercial (Cambio) en un tub de microcentrífuga i es desnaturalitza a 65º C durant 10 min. Es deixa dins l’estufa a 37ºC prehibridant durant 60 min com a màxim mentre es fa el tractament del portaobjectes.
Material i Mètodes_______________________________________________________________________
- 78 -
x HibridacióLa preparació cromosòmica es desnaturalitza en formamida al 70% a 73º C durant 5 min si prové de sang perifèrica (4 min si prové de líquid amniòtic o cultiu de vellositat corial). Després es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% 1 min en cadascun. Es deixa assecar a temperatura ambient. Mentrestant es barreja la sonda amb aigua miliQ i solució d’hibridació específica per la sonda en les proporcions recomanades per la casa comercial. Es desnaturalitza la barreja a 73ºC durant 5 min. La sonda desnaturalitzada s’aplica sobre el portaobjectes, ja sec, i es cobreix amb un cobreobjectes de 20x20. Es segella amb goma i es deixa hibridar a 37º C o/n en una caixa humida.
x Rentats posthibridació
Es treu el cobreobjectes amb compte i es renta l’excés de sonda i la hibridació inespecífica submergint la preparació en 0,4xSSC/0,3 NP-40 a 73ºC 2 min i s’agita.
Després es renta en 2xSSC/0,1 NP-40 a temperatura ambient. S’afegeixen 10 Pl d’una dilució DAPI ¼ (0,032 ng/Pl) en antifade (Vectashield). Es posa un cobreojectes de 22x22 mm i es guarda a la nevera fins al seu anàlisi.
x Anàlisi
Per capturar la fluorescència de les metafases ben hibridades i per l’anàlisi s’utilitza un microscopi de fluorescència que conté filtres per SpectrumGreen (U-MNIBA), SpectrumOrange
(U-MNG) i DAPI (U-MNU). Segons com estigui marcada la sonda s’utilitza el filtre de
SpectrumGreen i/o SpectrumOrange. Les imatges s’obtenen a través d’una càmara CCD i amb l’ajut d’un software específic (Cytovision, Applied Imaging, Sunderland, UK).
Les imatges corresponents a la fluorescència de DAPI s’inverteixen i serveixen per comprovar en quin cromosoma es troba la senyal de fluorescència.
Per cada cas s’analitzen 8-10 metafases.
3.6.2.2- Tècnica de pintat cromosòmic (WCP)
La tècnica de pintat cromosòmic s’ha emprat per confirmar resultats obtinguts amb altres tècniques citogenètiques.
x Envelliment
Abans de procedir a la hibridació s’ha d’envellir la preparació. Si no es vol continuar amb el protocol en el mateix moment, es pot guardar a –20ºC fins a la seva utilització.
x Postfixació
Es renta la preparació en PBS 1X durant 5 min a temperatura ambient, es deshidrata en etanols 70%, 85% i 100% i es deixa assecar.
x Desnaturalització de la sonda
Es posen 2,5 Pl de la sonda comercial (Cambio) en un tub de microcentrífuga i es desnaturalitza a 65º C durant 10 min. Es deixa dins l’estufa a 37ºC prehibridant durant 60 min com a màxim mentre es fa el tractament del portaobjectes.
_______________________________________________________________________Material i Mètodes
x Postfixació
Es submergeix la preparació en una solució de pepsina (49,5 ml H2O miliQ, 0,5 ml HCl 1M, 25Pl de pepsina (100 mg/ml)) a 37ºC durant 5 min. És molt important que la pepsina s’afegeixi just abans de submergir el portaobjectes. El temps de tractament amb la pepsina varia depenent del tipus de mostra i de la quantitat de citoplasma. Es submergeix en 2xSSC durant 5 min dues vegades seguides. Es tracta amb formaldehid durant 2 min (en el cas que el formaldehid no s’hagi fet el mateix dia el temps s’augmentarà 1 o 2 min). Es fan dos rentats amb PBS 1X a temperatura ambient durant 5 min i es deshidrata el portaobjectes en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% durant 1 min cadascun i es deixa assecar.
x Hibridació
La mostra es desnaturalitza en formamida al 70% a 73ºC durant 5 min. Seguidament es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% freds i es deixa assecar a temperatura ambient. S’afegeixen 2,5 Pl de la sonda desnaturalitzada sobre la zona a hibridar i es posa un cobreobjectes de 20x20mm. Es segella amb goma i es deixa hibridar en càmera fosca humida a 37ºC o/n.
x Rentats posthibridació
Es treu el cobreobjectes amb compte i es renta l’excés de sonda i la hibridació inespecífica submergint la preparació en 0,4xSSC/0,3 NP-40 a 73ºC durant 2 min i s’agita. Després es renta en 2xSSC/0,1 NP-40 a temperatura ambient durant 2 min i es deixa assecar. S’afegeixen 10 Pl d’una dilució DAPI ¼ (0,032 ng/Pl) en antifade (Vectashield). Es posa un cobreojectes de 22x22 mm i es guarda a la nevera fins al seu anàlisi.
x Anàlisi
Per a l’anàlisi s’utilitza un microscopi de fluorescència que conté filtres per SpectrumGreen
(U-MNIBA), SpectrumOrange (U-MNG) i DAPI (U-MNU) per capturar la fluorescència de les metafases ben hibridades. S’utilitza el filtre de SpectrumGreen o SpectrumOrange segons com estigui marcada la sonda de pintat cromosòmic. Les imatges s’obtenen a través d’una càmera CCD amb l’ajut d’un software específic (Cytovision, Applied Imaging, Sunderland, UK).
Les imatges corresponents a la fluorescència de DAPI s’inverteixen per tal de comprovar en quin cromosoma hi ha la senyal de la sonda utilitzada.
Per cada cas s’analitzen 8-10 metafases.
_______________________________________________________________________Material i Mètodes
x Postfixació
Es submergeix la preparació en una solució de pepsina (49,5 ml H2O miliQ, 0,5 ml HCl 1M, 25Pl de pepsina (100 mg/ml)) a 37ºC durant 5 min. És molt important que la pepsina s’afegeixi just abans de submergir el portaobjectes. El temps de tractament amb la pepsina varia depenent del tipus de mostra i de la quantitat de citoplasma. Es submergeix en 2xSSC durant 5 min dues vegades seguides. Es tracta amb formaldehid durant 2 min (en el cas que el formaldehid no s’hagi fet el mateix dia el temps s’augmentarà 1 o 2 min). Es fan dos rentats amb PBS 1X a temperatura ambient durant 5 min i es deshidrata el portaobjectes en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% durant 1 min cadascun i es deixa assecar.
x Hibridació
La mostra es desnaturalitza en formamida al 70% a 73ºC durant 5 min. Seguidament es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% freds i es deixa assecar a temperatura ambient. S’afegeixen 2,5 Pl de la sonda desnaturalitzada sobre la zona a hibridar i es posa un cobreobjectes de 20x20mm. Es segella amb goma i es deixa hibridar en càmera fosca humida a 37ºC o/n.
x Rentats posthibridació
Es treu el cobreobjectes amb compte i es renta l’excés de sonda i la hibridació inespecífica submergint la preparació en 0,4xSSC/0,3 NP-40 a 73ºC durant 2 min i s’agita. Després es renta en 2xSSC/0,1 NP-40 a temperatura ambient durant 2 min i es deixa assecar. S’afegeixen 10 Pl d’una dilució DAPI ¼ (0,032 ng/Pl) en antifade (Vectashield). Es posa un cobreojectes de 22x22 mm i es guarda a la nevera fins al seu anàlisi.
x Anàlisi
Per a l’anàlisi s’utilitza un microscopi de fluorescència que conté filtres per SpectrumGreen
(U-MNIBA), SpectrumOrange (U-MNG) i DAPI (U-MNU) per capturar la fluorescència de les metafases ben hibridades. S’utilitza el filtre de SpectrumGreen o SpectrumOrange segons com estigui marcada la sonda de pintat cromosòmic. Les imatges s’obtenen a través d’una càmera CCD amb l’ajut d’un software específic (Cytovision, Applied Imaging, Sunderland, UK).
Les imatges corresponents a la fluorescència de DAPI s’inverteixen per tal de comprovar en quin cromosoma hi ha la senyal de la sonda utilitzada.
Material i Mètodes_______________________________________________________________________
- 80 -
3.6.3- TÈCNICA D’HIBRIDACIÓ IN SITU FLUORESCENT
MULTIPINTAT O MULTIPLEX (M-FISH)
Amb aquesta metodologia, en un sol experiment d’hibridació, es poden visualitzar tots els cromosomes homòlegs pintats d’un color específic (Fig.3).
x Envelliment d’extensions
Abans de procedir a la hibridació s’ha d’envellir la preparació cromosòmica. Una vegada envellit el material si no es vol continuar amb el protocol es pot guardar a –20ºC fins a la seva utilització.
x Postfixació
Es treu la preparació cromosòmica del congelador i es deixa assecar a l’aire durant 1 min. Abans de procedir amb la hibridació es fa un tractament de postfixació. Es renta el portaobjectes en PBS 1X durant 5 min a temperatura ambient. Seguidament es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% durant 1 min en cada un i es deixa assecar. Es submergeix en una solució de pepsina (49,5 ml H2O miliQ, 0,5 ml HCl 1M, 25 Pl de pepsina (100 mg/ml)) a 37ºC durant 5 min. És molt important que la pepsina s’afegeixi just abans de submergir la preparació. El temps de tractament amb la pepsina variarà depenent del tipus de mostra i també de la quantitat de citoplasma. Es submergeix en 2xSSC, durant 5 min, dues vegades seguides i a continuació es tracta amb formaldehid (41,14 ml H2O miliQ, 2,5 ml MgCl2, 5 ml 10xPBS, 1,35 ml Formaldehid 37 %) durant 2 min a temperatura ambient. En el cas que el formaldehid no s’hagi fet el mateix dia el temps s’augmentarà 1 o 2 min. Es fan dos rentats amb PBS 1X, a temperatura ambient, durant 5 min. Es deshidrata el portaobjectes en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% durant 1 min en cadascun i es deixa assecar.
x Hibridació
La mostra es desnaturalitza en formamida al 70% a 73ºC durant 5 min. Seguidament es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% durant 1 min en cadascun i es deixa assecar a temperatura ambient. Mentrestant es desnaturalitzen 2,5Pl de sonda (5Pl si la preparació és pobre en número de metafases) a 73ºC durant 5 min. La sonda desnaturalitzada s’aplica sobre l’extensió cromosòmica també desnaturalitzada i seca. Es cobreix amb un cobreobjectes de 20x20mm partit per la meitat en el cas que apliquem 2,5 Pl (o el cobreobjectes sencer si apliquem 5 Pl de sonda). Es deixa hibridar a 37º C o/n en una caixa humida.
x Rentats posthibridació
Es treu el cobreobjectes amb compte i es renta l’excés de sonda i la hibridació inespecífica submergint el portaobjectes en 0,4xSSC/0,3NP-40 a 73ºC agitant durant 2 min. Després es renta en 2xSSC/0,1 NP-40 a temperatura ambient durant 2 min i es deixa assecar. S’afegeixen 10 Pl de dilució DAPI ¼ (0,032 ng/Pl) en antifade (Vectashield). Es posa un cobreojectes de 22x22 mm i es guarda a la nevera fins al seu anàlisi.
x Anàlisi
La captura de les imatges es va realitzar mitjançant un microscopi epifluorescent Olympus AX60 (Olympus Optical CO, Hamburg, Germany) equipat amb una roda de filtres específics per
Material i Mètodes_______________________________________________________________________
- 80 -
3.6.3- TÈCNICA D’HIBRIDACIÓ IN SITU FLUORESCENT
MULTIPINTAT O MULTIPLEX (M-FISH)
Amb aquesta metodologia, en un sol experiment d’hibridació, es poden visualitzar tots els cromosomes homòlegs pintats d’un color específic (Fig.3).
x Envelliment d’extensions
Abans de procedir a la hibridació s’ha d’envellir la preparació cromosòmica. Una vegada envellit el material si no es vol continuar amb el protocol es pot guardar a –20ºC fins a la seva utilització.
x Postfixació
Es treu la preparació cromosòmica del congelador i es deixa assecar a l’aire durant 1 min. Abans de procedir amb la hibridació es fa un tractament de postfixació. Es renta el portaobjectes en PBS 1X durant 5 min a temperatura ambient. Seguidament es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% durant 1 min en cada un i es deixa assecar. Es submergeix en una solució de pepsina (49,5 ml H2O miliQ, 0,5 ml HCl 1M, 25 Pl de pepsina (100 mg/ml)) a 37ºC durant 5 min. És molt important que la pepsina s’afegeixi just abans de submergir la preparació. El temps de tractament amb la pepsina variarà depenent del tipus de mostra i també de la quantitat de citoplasma. Es submergeix en 2xSSC, durant 5 min, dues vegades seguides i a continuació es tracta amb formaldehid (41,14 ml H2O miliQ, 2,5 ml MgCl2, 5 ml 10xPBS, 1,35 ml Formaldehid 37 %) durant 2 min a temperatura ambient. En el cas que el formaldehid no s’hagi fet el mateix dia el temps s’augmentarà 1 o 2 min. Es fan dos rentats amb PBS 1X, a temperatura ambient, durant 5 min. Es deshidrata el portaobjectes en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% durant 1 min en cadascun i es deixa assecar.
x Hibridació
La mostra es desnaturalitza en formamida al 70% a 73ºC durant 5 min. Seguidament es deshidrata en una sèrie d’etanols 70%, 85% i 100% durant 1 min en cadascun i es deixa assecar a temperatura ambient. Mentrestant es desnaturalitzen 2,5Pl de sonda (5Pl si la preparació és pobre en número de metafases) a 73ºC durant 5 min. La sonda desnaturalitzada s’aplica sobre l’extensió cromosòmica també desnaturalitzada i seca. Es cobreix amb un cobreobjectes de 20x20mm partit per la meitat en el cas que apliquem 2,5 Pl (o el cobreobjectes sencer si apliquem 5 Pl de sonda). Es deixa hibridar a 37º C o/n en una caixa humida.
x Rentats posthibridació
Es treu el cobreobjectes amb compte i es renta l’excés de sonda i la hibridació inespecífica submergint el portaobjectes en 0,4xSSC/0,3NP-40 a 73ºC agitant durant 2 min. Després es renta en 2xSSC/0,1 NP-40 a temperatura ambient durant 2 min i es deixa assecar. S’afegeixen 10 Pl de dilució DAPI ¼ (0,032 ng/Pl) en antifade (Vectashield). Es posa un cobreojectes de 22x22 mm i es guarda a la nevera fins al seu anàlisi.
x Anàlisi
La captura de les imatges es va realitzar mitjançant un microscopi epifluorescent Olympus AX60 (Olympus Optical CO, Hamburg, Germany) equipat amb una roda de filtres específics per
_______________________________________________________________________Material i Mètodes
SpectrumAqua,SpectrumFred,SpectrumGold,SpectrumGreen, SpectrumRed, DAPI i un filtre de triple banda (FITC/PI/DAPI). El microscopi està dotat d’una càmera CCD d’alta sensibilitat refrigerada (Photometrics Sensys) que està acoblat a un sistema de captura Smartcapture
(Vysis) i un software específic per M-FISH (Quips Spectraysion software, Vysis).
Cada parella de cromosomes homòlegs es marca amb una combinació específica de fluorocroms (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7) (Fig.28).
Per cada cas s’han analitzat 8-10 metafases.
Cromosoma SpectrumFred Spectrum Aqua
Spectrum
Green SpectrumGold SpectrumRed 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Fig.28- Composició de fluorocroms de les sondes específiques per a cada cromosoma en la tècnica de M-FISH
_______________________________________________________________________Material i Mètodes
SpectrumAqua,SpectrumFred,SpectrumGold,SpectrumGreen, SpectrumRed, DAPI i un filtre de triple banda (FITC/PI/DAPI). El microscopi està dotat d’una càmera CCD d’alta sensibilitat refrigerada (Photometrics Sensys) que està acoblat a un sistema de captura Smartcapture
(Vysis) i un software específic per M-FISH (Quips Spectraysion software, Vysis).
Cada parella de cromosomes homòlegs es marca amb una combinació específica de fluorocroms (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7) (Fig.28).
Per cada cas s’han analitzat 8-10 metafases.
Cromosoma SpectrumFred Spectrum Aqua
Spectrum
Green SpectrumGold SpectrumRed 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Fig.28- Composició de fluorocroms de les sondes específiques per a cada cromosoma en la tècnica de M-FISH
Material i Mètodes_______________________________________________________________________
- 82 -
3.6.4- FISH MULTICOLOR ESPECÍFICA DE CENTRÒMER (cenM-FISH)
Aquest treball s’ha realitzat durant l’estada al laboratori del Dr. Thomas Liehr a l’Institut für Humangenetic und Antropologie, Jena, Alemanya.
x Obtenció de la sonda
L’ADN específic de centròmer que està en plàsmidis i l’ADN de llibreries de microdissecció pel centròmer del cromosoma 5 s’amplifica pel mètode de la reacció en cadena de la polimerasa amb oligonucleòtids degenerats (DOP-PCR) en un volum de 50 Pl d’acord amb el mètode de Senger i col. (1998). Cada tipus d’ADN es marca separadament utilitzant una segona DOP-PCR en un volum de 20 Pl.
El marcatge es realitza segons l’esquema de la Figura 29 amb dUTPs marcats amb biotina, dietilaminocumarina, SpectrumRed, SpectrumOrange o SpectrumGreen. Totes les sondes marcades es barregen i s’aliquoten en 25 porcions iguals i cadascuna es precipita amb 25 Pg de t-RNA i 2 Pg de COT1-DNA. L’ADN COT-1 és necessari per evitar la hibridació entrecreuada de les sondes centromèriques. Els botons d’ADN s’assequen al buit i s’emmagatzemen a –20ºC fins a la seva utilització.