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EMBRIOGÉNICAS EN SUSPEN- SIÓN) PREVIAMENTE ESTABLECI- DAS DE FHIA 21

Regeneración de plantas a partir de CES. A partir de células embriogénicas en suspensión previamente estableci- das del cultivar FHIA 21, se tomó una suspensión celular con un volumen ce- Figura 1. (A) Escalpo completo, (B) Escalpo procesado, (C) CI, (D) Agregado Embriogénico 40X

lular establecido (SCV) del 3%.

Posteriormente se tomó 1 mL de la suspensión celular y se colocó en una malla plástica como soporte, en 20mL de medio RD1 (medio de regeneración de embriones) en frascos de compota, cada 15 días se realizó cambio de medio durante dos meses hasta la maduración de los embriones. Una vez obtenidos los embriones maduros se transfirieron a medio de germinación de embriones RD2 (medio de germinación de embriones) e igualmen- te se realizó el cambio de medio cada 15 dias, hasta obtener la germinación de embriones y la obtención de plántulas (Shoofs, 1997).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE PROTOCOLOS PARA LA OBTENCIÓN DE ESCALPOS DE

Musa (HARTÓN COMÚN) A PARTIR DE PLANTAS in vitro

Introducción y multiplicación In vitro de Musa (Hartón común). Con los protocolos validados y previamente optimizados en el laboratorio de micropropagación de plántulas de CORPOICA, se obtuvo 92% de sobrevivencia de los meristemos introducidos In vitro y una tasa de multiplicación del material del 1.5 a 2 en medio de multipli- cación, obteniéndose clusters de plántulas In vitro como material base para la obtención de escalpos.

Inducción de escalpos a partir de plantas In vitro. El mayor porcentaje de escalpos (43 al 72 %), se obtuvo entre los pases 10-13. Estos resultados están acordes con los reportes realizados en los que se refieren a que el número de subcultivos para obtener el mayor número de escalpos varia de clon a clon pero que usualmente va de 2 a 10 (Strosse et al., 2003).

ESTANDARIZACIÓN DE PROTOCOLOS EFICIENTES PARA LA OBTENCIÓN DE CALLOS FRIABLES

EMBRIOGÉNICOS O CALLO IDEAL (CI), A PARTIR DE ESCALPOS DE Musa (HARTÓN COMÚN)

Inducción de callo embriogénico en escalpos completos. En las evaluaciones se observó que 75% de los escalpos formó en un período de 3 meses un callo acuoso con aumento de tamaño, debido posiblemente a la presencia de tejido foliar y de cormo y 20% de los callos formados fueron compactos y se observó un crecimiento de tamaño, debido posiblemente a la presencia de cormo y 5% no reaccionaron (Strosse et al., 2003). Los callos obtenidos por este procedimiento no fueron óptimos para iniciar una suspensión celular, lo cual llevó a plantear el procedimiento descrito a continuación para lograr una mejor inducción del callo embriogénico. Inducción de callo friable embriogénico o callo ideal (CI) en escalpos seleccionados y procesados. En condiciones de fotoperíodo de 12 h, los escalpos procesados empezaron a mostrar respuesta de formación de glóbulos meristemáticos, así como también el inicio de la formación de callo compacto y callo acuoso a partir del primer mes de cultivado en el medio ZZss (Shoofs, 1997), también se observó ennegrecimiento del escalpo cultivado, lo cual es un buen indicador de que se inoculó poco tejido foliar. Los datos obtenidos en este período fueron los siguientes: 30% en la formación de glóbulos meristemáticos, 21% con formación de callo acuoso y 20% de callo compacto; 7% y 9% de callo acuoso y compacto con glóbulo, respectivamente. El porcentaje de no reacción fue del 25% y de necrosis 2%.

En el segundo mes, se incrementó el porcentaje de explantes con glóbulos meristemáticos en 41%, el porcen- taje de callo acuoso con glóbulos fue del 14%; en cuanto a la formación de callo acuoso se obtuvo 42%. El porcentaje de mortalidad de los escalpos fue del 4% y de no reacción fue del 0.4%.

En el tercer mes, los porcentajes de formación de glóbulos meristemáticos fueron de 44% y de 13% callo acuoso con glóbulos meristemáticos, la formación de callo acuoso fue de 14% y el de necrosis de 11%. Con estos datos se puede decir que la reacción de los explantes inoculados es similar a los resultados obtenidos en otras variedades (Shoofs, 1997; Strosse et al., 2003).

obteniéndose 87%, 3% de formación de callo compacto y 10% de callo necrótico, sin embargo, hasta este momento y bajo estas condiciones no se han obtenido callos friables embriogénicos o callos ideales.

En los explantes colocados en condiciones de oscuridad se obtuvo que al mes de iniciada la inducción, 22% de los escalpos formaron glóbulos meristemáticos, el 19% callo compacto con glóbulos, el 5 callo acuoso con glóbulos; la formación de callo acuoso fue del 21% y de callo compacto del 35%.

A los 2 meses, en el procedimiento realizado bajo condiciones de oscuridad, se obtuvo 11% en el desarrollo de glóbulos meristemáticos; 34% y 36% en la formación de callos acuosos y compactos, respectivamente, la formación de callo compacto con glóbulo fue del 4% y del 0.4% callo acuosos con glóbulo. A los 3 meses se incrementó la formación de glóbulos obteniéndose 52%, 1% de callos compactos y 48.1 % de necrosis. Entre los 4 y 5 meses la formación de glóbulos se incrementó, obteniéndose 93%, también se observó la formación de callo embriogénico friable o callo ideal (CI) (Figura 2C) del 0.5%, y 0.9% de callo acuoso y 6% de necrosis.

Estos resultados preliminares indican que con este procedimiento de inducción de escalpos en condiciones de oscuridad a 26ºC+/-2, se han podido obtener 0.5 % de callos ideales en la variedad de Hartón común, indispen- sables para la iniciación de una suspensión celular.

DISGREGACIÓN DE CALLO FRIABLE EMBRIOGÉNICO O CI EN MEDIO LÍQUIDO

Disgregación en medio líquido de callo friable pero acuoso de Musa (Hartón común) obtenidos a partir de la inducción de escalpos completos. Los resultados obtenidos de la evaluación microscópica de la disgregación del callo formado a partir de escalpos completos donde se obtuvo un callo friable pero acuoso en medio ZZl (Shoofs, 1997), observándose de 0 a 3 meses después de la iniciación de CES, fueron los siguientes: a. Agregados de forma esférica, caracterizados por una capa externa de células de almidón, con su centro compuesto de células meristemáticas.

b. Células aisladas o pequeñas células no unidas, cuyos agregados consistieron en células parenquimatosas con reservas de almidón, así como también pocas células embriogénicas presentes.

Esta evaluación demostró que estas células no eran las propicias para iniciar una suspensión celular (Georget,

et al., 2000; Strosse et al., 2003).

Disgregación en medio líquido de callo friable embriogénico ó CI de Musa (Hartón común) obtenido a partir de escalpos procesados. Los resultados obtenidos de la evaluación microscópica de la disgregación en medio líquido del callo formado a partir de escalpos procesados donde se obtuvo un callo friable embriogénico ó CI, observándose de 0 a 3 meses de después de la iniciación de CES, fueron los siguientes:

a. Agregados de células embriogénicas: Agregados compuestos por numerosas zonas embriogénicas orga- nizadas alrededor de la periferia. Estas zonas embriogénicas consistieron en células con alto radio citoplasmático y citoplasma denso (Georget, et al., 2000).

b. Algunas células parenquimatosas en la superficie de la suspensión. Con estos resultados preliminares se puede concluir que al procesar los escalpos se lograron inducir con la menor cantidad de hojas y de cormo la formación de callos friables embriogénicos ó CI, que al ser disgregados en medio líquido ZZl (Shoofs,1997), está permitiendo la iniciación de la suspensión celular.