The Finalised Questionnaire

Inés Sánchez1

Jorge Alberto Valencia2

Duverney Gaviria1 Yamile Cortés1 Gerardo Gallego3 Adriana Almeida3 Diego Fajardo4 Eloína Mesa5 Joe Tohme3 RESUMEN

La Colección Colombiana de Musáceas (CCM), situada en Montenegro, Quindío, finca El Agrado, a 1310 m.s.n.m., es la única con plátanos adaptados a agroecosistemas de altitud. Sólo unas pocas accesiones fueron caracterizadas con marcadores morfológicos y agronómicos por el ICA, lo que hace necesaria la elaboración de unos descriptores que faciliten la identificación de sinónimos para los diferentes países y mejore la descripción de la variabilidad existente. En este trabajo, se concluyó la caracterización morfoagronómica con el análisis de 150 descriptores. Confrontando dichos grupos, con los obtenidos de los AFLP y los RAPD, se estableció una distribución de la Colección incluyendo diploides AA, BB y los híbridos interespecíficos donde se encuentran los “plátanos colombianos” y testigos para cada uno de los grupos suministrados por el CIRAD-FHLOR (Guadeloupe, Antillas Francesas), con el objetivo de analizar con microsatélites, dichos plátanos en un contexto de su estructuración en subgrupos de los triploides interespecíficos y homologar la CCM con la descripción internacional. Los resultados obtenidos permiten el conocimiento de la diversidad genética de las diferentes entradas en la CCM. Igualmente se genera información útil para su manejo con la identificación de duplicados reduciendo costos en la multiplicación y conservación tanto in vitro como en el campo; para lo cual, basados en los resultados de estos análisis, se hacen algunas recomendaciones. En un banco de germoplasma se da valor agregado efectivo a la biodiversidad, a través de los distintos procesos de evaluación, caracterización y mejoramiento.

INTRODUCCIÓN

En Corpoica, se dispone de un sistema de bancos de germoplasma vegetal, que se establecen como centros de recursos fitogenéticos nacionales. Dichos bancos, conservan gran cantidad de muestras de germoplasma de interés actual o potencial, entre ellos las Musáceas, compuestas por dos géneros, Musa y Ensete. El género

Musa incluye 30 especies, que se encuentran principalmente en las regiones tropicales; desde la India hasta la Polynesia, con un máximo de diversidad en Indonesia. Este género que es de gran importancia económica, se divide en cuatro secciones: Eumusa, Australimusa, Callimusa y Rhodochlamys (Simmonds, 1962, 1973); la sección Emusa, la mayor y de más difusión geográfica entre todas las de este género, ha dado origen a la inmensa mayoría de los plátanos comestibles, derivados de las especies Musa acuminata (Genoma A)y Musa balbisiana (Genoma B) (Horry, 1989).

De las Musáceas comestibles, aproximadamente cinco clones son los más cultivados y explotados en Colom- bia, correspondiendo su uso a la alimentación humana y comercialización del fruto. Estos se ven a lo largo y ancho del país, desde el nivel del mar hasta los 2000 m.s.n.m., con una superficie de cultivo de 400.000 ha. y una producción de 2.5 millones de ton. Lo anterior muestra la amplia variedad de condiciones ecológicas en las

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CORPOICA–CIAT

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CORPOICA - El Agrado- Armenia

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CIAT–BRU

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cuales se desarrolla el cultivo y su importancia social y económica. (Belalcazar,1991)

La Colección Colombiana de Musáceas (CCM), situada en Armenia, departamento del Quindío, finca El Agrado, a 1310 m.s.n.m., es la única con plátanos adaptados a agroecosistemas de altitud. Esta Colección cuenta actualmente con 145 entradas, de las cuales sólo unas pocas fueron caracterizadas con marcadores morfológicos y agronómicos por el ICA, en sus variables de crecimiento, desarrollo y producción (Belalcázar, 1991); sin embargo, se requiere profundizar en la caracterización morfoagronómica para estandarizar metodologías y terminologías.

La explotación de las Musáceas comestibles está limitada por una serie de plagas y enfermedades de importan- cia, entre las que se encuentran Picudo negro, Cosmopolites sordidus; Picudo rayado, Metamasius hemipterus,

Moko, Pseudomonas salanacearun; Sigatoka negra Mycosphaerella fijiensis, Sigatoka amarilla Mycosphaerella musicola; Virus del Mosaico del pepino, CMV y el virus del rayado del banano, BSV, entre otros. Esta situación hace necesarios el conocimiento y análisis de la diversidad genética y la realización de evaluaciones, ampliando las posibilidades de selección de algunos clones promisorios. Los problemas ocasionados por las plagas de importancia económica, en Musáceas, han encontrado solución directa en la diversidad genética de las espe- cies (Valencia, 1988).

Los estudios realizados en este trabajo, basados en la caracterización morfológica, y molecular, permitirán un mejor entendimiento del genoma del género Musa y el conocimiento de la diversidad genética de las diferentes entradas de la CCM. Igualmente se genera información útil para su manejo, como la identificación de duplica- dos, para lo cual se hacen algunas recomendaciones, permitiendo tener en el banco una muestra representativa de la diversidad genética, reduciendo costos en la multiplicación y conservación tanto in vitro como en el campo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Caracterización morfoagronómica. La distribución de los materiales en el campo experimental, se basó en una clasificación preliminar por constitución genómica. Una clasificación propuesta por Cheesman (1948) para el género Musa, es aceptado actualmente en todos los países y se basa en el número básico de cromosomas (Loyola et al., 1993), dividiéndose en dos grupos: especies con cromosomas n=10 pertenecientes a las seccio- nes Australimusa y Callimusa y especies con cromosomas n=11, integradas por las secciones Rhodochlamys y Eumusa. Las especies componentes de estas dos últimas secciones son los que presentan potencialidad como germoplasma útil para mejoramiento genético de las variedades cultivadas.

Por cada una de las entradas que conforman el banco, se sembraron seis sitios. La distancia de siembra utilizada fue de 3.5 m. entre surcos por 3.5 m. entre sitios. La siembra en el campo se realizó en un lote con una superficie de 12.000 m2 _{aproximadamente, ubicado en la Estación Experimental El Agrado del Comité de Cafe-} teros del Quindío, situado en la región Andina en el Corregimiento de Pueblo Tapao, municipio de Montenegro, a una altura de 1350 m.s.n.m., la temperatura media es de 22 °C y una precipitación media de 2100 mm anuales. Según la clasificación de Holdridge, su ecosistema corresponde a bosque húmedo premontano (bh PM), con dos períodos de lluvia que van de marzo a mayo y de septiembre a noviembre, tiene a su vez dos épocas secas que son de diciembre a febrero y de junio a agosto.

Se utilizaron los descriptores para el género Musa desarrollados por el IPGRI–INIBAP/ CIRAD (1996) aplica- dos a cada una de las entradas del Banco de Germoplasma. Los descriptores fueron agrupados de la siguiente manera:

Apariencia general de la planta Seudotallo

Pecíolo/nervadura hoja

Inflorescencia yema masculina Bracteas

Fruto

Descriptores de la planta

Del total de 145 entradas disponibles se aplicó el protocolo de caracterización a 127 clones. Se efectuó una clasificación preliminar de los clones del Banco de Germoplasma, para lo cual se consideró dentro del género

Musa, la sección, especie/grupo, subespecie/subgrupo y cultivar/tipo.

Se creó una base de datos con los descriptores tomados en el campo a cada entrada del Banco de Germoplasma. También se realizó una codificación por descriptor (V1… Vn), para facilitar el análisis estadístico, mediante cálculo de la desviación estándar, coeficiente de variación y correlaciones. El análisis de conglomerados se realizó a partir de nuevos ejes de coordenadas del análisis de correspondencia.

Caracterización molecular. Los análisis moleculares se realizan en los laboratorios de la Unidad de Biotecnología del CIAT. El ADN se aisló de acuerdo con los métodos de Doyle y Doyle (2000). Como marcadores moleculares se usaron los AFLP (Amplified fragment length plymorphism) descritos por Vos, et al. (1995), los RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN), descritos por Williams et al. (1990) y microsatélites (Lagoda et al.1988), para los cuales se tuvieron como controles, ADN de la colección del CIRAD-Gualeloupe (Tabla 1).

Para los microsatélites (Tabla 2), se incluyeron algunas modificaciones. Dichas modificaciones incluyen: un lavado adicional con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), en este caso se realizaron microextracciones en tu- bos eppendorf, en el paso con el isopropanol, no se dejó a temperatura ambiente si no a –20o_{C durante la noche} para conseguir un buen precipitado del ADN. Se eliminó el lavado con isopropanol, con acetato de sodio y etanol a 70%. Con estas modificaciones se obtuvo un ADN de mejor calidad y concentración de aproximada- mente 150ng/μL

Las electroforesis para comprobar la calidad del ADN se hicieron en geles de agarosa al 0.8% P/V, para PCR, el gel de agarosa fue de 1.5% P/V.

Se realizaron las diluciones de los primers a una concentración final de 20µM, se cuantificó el ADN, para realizar una dilución a una concentración final de 5ngr/µL.

La técnica de PCR se realizó de acuerdo a protocolo suministrado por el CIRAD (Françoise Carreel).

El tener como control los patrones suministrados por el CIRAD, permite la ubicación de las diferentes bandas en cada ”primer” pudiendo identificar y evaluar el polimorfismo perteneciente a cada “primer” con todas las mues- tras.

Métodos de análisis. Para los análisis de resultados se utilizó el método de Componentes Principales (ACP) con SAS Version 6 (1989) y el programa NTSYS version 2.1 (Rolph, 2000) para los análisis de tasas de similaridad.

RESULTADOS

Caracterización morfoagronómica. Para los análisis morfoagronómicos se establecieron algunas características por subgrupo.

Los diploides poseen hojas y pecíolos más rígidos que los triploides y estos más que los tetraploides.

Subgrupo Sucrier: Único diploide comestible importante del tipo acuminata (AA) de frutos dulces, cáscara delgada, vainas color verdeamarillo, follaje amarillento y virtualmente sin cera, racimos pequeños y plantas poco rendidoras, resistente al Mal de Panamá, susceptible a Sigatoka amarilla, y en condiciones de Colombia mostró susceptibilidad a Mycosphaerella fijiensis.

o rosado pálido, fruto de color amarillo brillante a la madurez, susceptibles al Mal de Panamá, frutos delgados marcadamente curvos. La planta es grande, vigorosa y produce racimos pesados y simétricos.

Subgrupo Cavendish: Triploide del tipo acuminata (AAA) de frutos con punta roma, vainas interiores (espe- cialmente en los retoños jóvenes) de color rojo brillante, fruto verdoso a la madurez, inmunes al Mal de Panamá. Subgrupo Plantain: Triploide del grupo AAB, tépalo compuesto de color amarillo-anaranjado, eje masculino a veces ausente, o si está presente, envuelto en ocasiones por las brácteas masculinas persistentes y relictos florales, frutos gruesos de cuello de botella pulpa dulce, botella delgada, brácteas deciduas.

Subgrupo Mysore: Triploide del grupo AAB, tépalo compuesto, blanco, con tinte rosado más o menos intenso, con dientes amarillo o anaranjado-amarillento en su totalidad, eje masculino presente, brácteas y flores mascu- linas deciduas, nervios centrales color púpura-rósaceo.

Subgrupo Popolou: Triploide del grupo AAB, tépalo compuesto, blanco, con tinte rosado más o menos intenso, con dientes amarillos o anaranjado-amarillento, pero no anaranjado-amarillento en su totalidad. Eje masculino presente, brácteas y flores masculinas deciduas, frutos romos.

Subgrupo Silk: Triploide del grupo AAB, tépalo compuesto, blanco, con tinte rosado o más o menos intenso, con dientes amarillos o anaranjados-amarillento, pero no anaranjado amarillento en su totalidad, eje masculino presente, brácteas y flores masculinas deciduas, frutos maduros con pulpa blanca, que tienden a rajarse longitudinalmente y a caer del racimo en la madurez, muy susceptible al Mal de Panamá.

Subgrupo Pome: Triploide del grupo AAB, tépalo compuesto blanco, con tinte rosado más o menos intenso, con dientes amarillos o anaranjdo-amarillento, pero no anaranjado amarillento en su totalidad, eje masculino pre- sente, brácteas y flores masculinas deciduas, frutos maduros con pulpa blanca cremosa, que no tienden a rajarse ni caerse en la madurez, resistente al Mal de Panamá.

Subgrupo Bluggoe: Triploide del grupo AAB, racimo denso, comestible crudo, manos muy espaciadas, frutos grandes, angulares, casi rectos, colocados en forma abierta, amiláceos en la madurez, el pedúnculo es conspicuamente largo y el racimo es penduloso, es resistente al Mal de Panamá.

Subgrupo Pisang Awak: Triploide del grupo AAB, racimo flácido, frutos grandes, plátano amiláceo para coci- nar, susceptible al Mal de Panamá, resistente a sequía, fruta de pulpa amilácea.

En total, en el Banco de Germoplasma de Musáceas-El Agrado, se analizaron 150 descriptores, resultando 37 variables, que representan el mayor peso en un Análisis de Componentes Principales (ACP) con SAS Version 6. Se obtuvo un dendograma determinando grupos morfoagronómicos (Figuras 1, Figura 2).

Los análisis tanto con el índice de Similaridad de Nei-Li, (Figura 1A), como los análisis de Componentes Princi- pales (Figura 1B), permiten establecer la conformación de ocho grupos asi:

Grupo 1, conformado por las entradas de Banano correspondientes a triploides y algunos diploides de acuminata. (A) de los subgrupos Gros Michel, Cavendish, Red, Ibota, Mutika/Lujugira y Sucrier.

Grupo 2, integrado por entradas correspondientes a triploides AAB del Subgrupo Plantain, incluyendo los tipos Dominico Hartón, Hartón y Dominico, el cual se complementa con el grupo 4, conformado igualmente por entra- das con genoma AAB del subrupo Plantain y del subgrupo Iholena.

Grupo 3, ubica las entradas con dominancia de balbisiana con genoma ABB y BB, correspondiente a los subgrupos Bluggoe, Pelipita, Saba y Musa balbisiana Taní.

Grupo 5, incluye diploides derivados de acuminata, un diploide AB y un triploide AAB del Subrupo Mysore, mostrando una afinidad con el cluster 1 en donde se ubican los bananos AAA.

Figura 1A. Dendograma determinando ocho grupos morfoagronómicos de cultivares de musáceas, obtenido de la evaluación de 150 descriptores, con el índice de similaridad de Nei-Li 1979; Dice 1945, programa NTSYS version 2.1, ROLPH, F.J. (2000)

Figura 1B. Ocho grupos de cultivares de musáceas, obtenidos del análisis de 150 descriptores con los que se obtuvieron 37 variables, que representan el mayor peso en un Análisis de Componentes Principales (ACP), SAS Versión 6 (1989)

Figura 2. Los individuos de izquierda a derecha son: (1)P. Hartón Común, (2) P. M‘Bouroukou, (3) P. Hartón Birracimo, (4 ) P. Hartón Habano, (5) P. Hartón santander, (6)P. Hartón Liberal, (7)P. Hartón Tigre, (8)P. Hartón Támesis Ant., (9)P. ¾ Nain, (10) Popoulou Pompo, (11) Popoulou Maia maoli, (12) Blugoe Cachaco Enano, (13)B. C. Común, (14)B. C. Espermo, (15)B. C. sin bellota, (16) Nakitengwa,

(17)Igitsiri/Intunto, (18 )Musabalbisiana tani, (19)

Madre del Platanal, (20)Pelipita Pelipita, (21)P. D. Hartón Común, (22)P. D. Hartón Rojo, (23) Victoria, (24) Pelipita Perrenque, (25) Hartón Pepo, (26)Pahang, (27) Gros Michel Común, (28) Cavendish, (29)P. D. Negro

Grupo 6, especialmente conformado por híbridos tetraploides y algunos clones que presentan dominancia de

balbisiana (BB) de los subgrupos Pome, Pisang Awak, Popoulou y Silk.

Grupo 7, conformado por especies silvestres de acuminata de los subgrupos Burmannica, Burmanicoides, Malaccencis, Siamea y Zebrina, así como entradas de la sección Rhodochlamys, constituyéndose los clones de este grupo en una fuente importante de genes de resistencia a los principales problemas fitosanitarios que afectan el cultivo de las Musáceas. Las entradas de este cluster son fértiles y producen polen y semillas sexua- les.

Grupo 8, lo integran las entradas correspondientes a las especies Musa balbisiana, M. basjoo, M. itinerans y M.

textilis, las tres primeras de la sección Eumusa y la última de la sección Australimusa.

La caracterización morfológica es un aporte para la interpretación de los resultados obtenidos en la caracteriza- ción molecular y constituye un mecanismo práctico para diferenciar materiales de importancia económica; me- diante la construcción de claves y cuya materia prima es la matriz de información obtenida en la caracterización morfológica. Sinembargo, es necesario tomar una cantidad de caracteres que permitan una buena representa- ción de las variables que tengan más peso en los análisis, para que los resultados puedan ser interpretados de acuerdo con su aplicabilidad en el campo.

Los 150 descriptores identificados se analizaron en conjunto con los marcadores isoenzimáticos (Reyes et al.

1998; Martinez et al. 1998; Jarret & Littz 1986a, b) y moleculares, permitiendo detectar además de los duplicados, los materiales con resistencia o tolerancia a los principales problemas, tales como el Picudo negro (Cosmopolites sordidus Germar). Se han identificado entradas como el Yangambi Km 5, el cual presenta resistencia a Sigatoka amarilla (Mycosphaerella musicola) bajo las condiciones del agrado. El FHIA 21, híbrido tetraploide (AAAB) de tipo plátano, mejorado por la FHIA (Fundación Hondureña de Investigación Agrícola,1994), presenta resistencia a la Sigatoka amarilla, buen comportamiento agronómico y es muy productivo. Dentro del grupo de los plátanos, se han identificado el Dominico hartón seudotallo rojo y el seudotallo verde, con racimos más estables en su conformación, 7 u 8 manos y alcanza más de 50 dedos por racimo; en contraste, con el Dominico Hartón Común, que se siembra en la zona cafetera, en el cual se han observado reversiones hacia el tipo Hartón común en cuanto a reducción en producción, con racimos de 5 manos y 30 dedos, mostrando así, una relativ a inestablilidad. En el dendograma de los AFLP, el Dominico Hartón común se encuentra genéticamente alejado del

Dominico Hartón Verde.

Caracterización molecular. De 70 oligonucleótidos de RAPD evaluados, 11 mostraron diferencias en los patrones de bandas en 82 accesiones. El dendograma con los marcadores RAPD, muestra los grupos formados por los genomas AAB y ABB donde se encuentra el grupo “Plantain”, cuyos rangos de similaridad son los mas altos entre 0.7 y 0.97, separado del grupo de M. acuminata ( AA y AAA), donde se obseva mas variabilidad. La variación en los marcadores RAPD, es muy útil en la diferenciación entre los grupos acuminata y balbisiana. Para los análisis con AFLP, se probaron 16 combinaciones de primer enzima, siendo seleccionadas las combinaciones E-AAG+M-CAT y E-AAG+M-CTT, por ser las que presentan mayor polimorfismo. Los resultados usando solo la combinación E-AAG+M-CAT, muestran166 bandas por gel, lo que corresponde a 25% del polimorfismo. Una matriz basada en el coeficiente de similaridad de Dice (1945), con agrupamientos por el promedio de ligamiento, UPGMA, analizada mediante el programa NTSYS versión 2.02 (Rolph. 1989), muestra los valores más altos (cerca de 100%) al interior de los genotipos Cavendish y Gros Michel. El dendograma muestra agrupamientos de acuerdo con el tipo de genoma. Al usar las dos combinaciones de oligonucleótidos para AFLP (E-AAG/M-CAT y E-AAG/M-CTT), para analizar 128 entradas (presentan como resultado 30% de bandas polimórficas en un total de 328 bandas. Los porcentajes de similaridad encontrados van desde 0,55 hasta 100%; mostrando así los rangos de variación genética. El análisis con UPGMA, agrupó por genoma y mostró una mayor diversidad genética dentro del grupo de los bananos (genoma AA y AAA). Los niveles más altos de similaridad, entre 0.9 y 1.0, se encontraron al interior del grupo formado por los Cavendish y los Gros Michel. Cuando se analizan los mismos individuos con las dos combinaciones, el grupo de los Gros Michel y los Cavendish, presentan igualmente, las más altas tasas de similaridad, entre 0.9 y 0.99, lo que muestra que dos combinaciones de oligonucleótidos de AFLP, técnica con la que se revelan muchos puntos en el genoma, proporcionan una muestra representativa para análisis de polimorfismos. El grupo de los plátanos (ABB) presentó rangos de similaridad más estrechos, pudiedose diferenciar la diversidad genética entre las variedades tradicionales “colombianas” y éstas a su vez de las introducciones recientes del Africa.

Los análisis con AFLP, han mostrado ser altamente efectivos en la distinción de los fenotipos de acuerdo con su tipo de genoma y cuantificar las difencias genéticas que exiten dentro de las diferentes agrupaciones por genoma. La variación en los marcadores RAPD, se muestra de gran utilidad en la diferenciación entre los grupos acuminata

y balbisiana. Tanto los marcadores de AFLP como los RAPD muestran que genéticamente, los plátanos son mas estrechamente relacionados entre sí, que los bananos, donde se encuentra mayor variabilidad genética. Debido a que en general solamente una entrada por sitio de origen fue analizada, no se pueden adelantar medidas de variación al interior de poblaciones o de sitios de origen de los materiales.

Los resultados obtenidos a partir de descriptores morfológicos, Isoenzimas, RAPD y AFLP contribuyen con otros marcadores moleculares de tipo codominate como los microsatélites y las evaluaciones agronómicas en el planteamiento o establecimiento de nuevas estrategias de mejoramiento.

Basados en los resultados de RAPD y de AFLP, se estableció una distribución de la Colección, incluyendo los dos grupos ancestrales silvestres AA y BB diploides y los híbridos interespecíficos donde se encuentran los “plátanos colombianos” y se introdujeron ADN de 20 nuevas accesiones, suministradas por el CIRAD que cuen- ta con mas de 400 entradas, representativos de cada uno de los grupos que existen en la Colección Colombiana de Musáceas (CCM). Dichos ADN se tomaron como patrones de control, además de los marcadores de peso