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Su mecanismo de acción implica tres pasos secuenciales. En primer lugar, el reconocimiento del antígeno específico por el dominio marcador, permitiendo que la inmunotoxina alcance la célula diana, seguido de la internalización del complejo vía endocitosis, para seguir distintas rutas de tráfico intracelular dependiendo de las características del inmunoconjugado. Durante esta etapa se produce la escisión de la toxina, permitiendo que finalmente sea liberada de las vesículas de transporte para ejercer

Figura I10. Mecanismo de acción de las inmunotoxinas y los conjugados droga-anticuerpo (CDA). La

exotoxina A de Pseudomonas (PE) y α-sarcina (αS) son liberadas del dominio marcador en los endosomas, pudiendo traslocarse al citoplasma o ser transportadas a través del aparato de Golgi al retículo endoplásmico (RE) (centro). La toxina diftérica (DT) se trasloca al citoplasma mediante la formación de poros en la membrana de los endosomas (derecha). Una vez en el citoplasma las tres toxinas realizan su actividad citotóxica (inhibición de la biosíntesis de proteínas o disrupción de Microtúbulos), provocando la apoptosis celular. Figura modificada de Alewine et al., 2015.

su actividad citotóxica, provocando la muerte de la célula objetivo (Pastan et al., 2007; Kreitman, 2009) (Figura I10).

Si bien este mecanismo es común a todas las inmunotoxinas, existen variaciones en el procesamiento intracelular dependiendo de los anticuerpos o fragmentos utilizados como dominios marcadores (Kuo et al., 2009, Fitzgerald et al., 2011; Sokolova et al., 2017), así como la liberación del componente tóxico y su localización subcelular, que depende específicamente de las propiedades de cada toxina (Alewine et al., 2015; Tomé-Amat et al., 2015). El proceso de unión e internación está dirigido por el dominio marcador, mientras que una vez internalizado en endosomas u otras vesículas está dirigida por las características de la toxina (Sakamoto et al., 2000 y 2006; Pastan et al., 2007).

Por este motivo, la eficacia de las inmunotoxinas de cara a su aplicación terapéutica está ligada a múltiples factores, entre los que destacan la estabilidad del inmunoconjugado, su biodistribución, penetración en tumores sólidos, la especifidad del dominio marcador, o la letalidad de la toxina (Kreitman, 2000; Weber et al., 2003, Alewine et al., 2015; Sokolova et al., 2017). Sin embargo, diversos estudios han mostrado uno de los factores que más influye en la eficacia de las inmunotoxinas está relacionada con el tráfico intracelular que siguen una vez internalizadas (Weldon & Pastan, 2011; Weng et al., 2012; Pasetto et al., 2015).

3.2.1.- Unión

La interacción con el antígeno celular específico constituye una etapa fundamental de cara a la actividad de la inmunotoxina, porque permite que el dominio tóxico alcance la célula diana con alta eficiencia y selectividad. Por tanto, una alta afinidad y una baja constante de disociación son propiedades capitales de las moléculas que se utilicen como dominio marcador (Schmidt et al., 2008; Cuesta et al., 2010).

3.2.2.- Internación

Una vez alcanzada la célula diana, las siguientes etapas vienen marcadas por las características de la toxina. Así, las toxinas formadoras de poros interaccionaran con las membranas, pero para aquellas que tienen como diana factores de señalización celular o la inhibición de la acción ribosomal, la internación del complejo antígeno-inmunotoxina tiene una alta incidencia en su eficacia, ya que la toxina requiere ser conducida a los orgánulos concretos para poder ejercer su actividad (Fitzgerald et al., 2011; Leal et al., 2014).

3.2.3.- Tráfico intracelular

Tras su internación, el complejo antígeno-inmunotoxina transita a través de los endosomas tempranos, donde la acidificación de estas vesículas puede producir la liberación de la toxina y su translocación al citosol, como en el caso de la toxina diftérica (Fuchs et al., 2013), o seguir la denominada vía retrograda, como la exotoxina A de Pseudomonas, las ribotoxinas y las proteínas RIP, que implica su transporte a través del aparato de Golgi al retículo endoplásmico, recorrido a través del cual estas toxinas se van liberando al citosol (De Lorenzo et al., 2007), proceso clave para la eficacia de dichas inmunotoxinas (Tortorella et al., 2012; Alewine et al., 2015).

3.2.4.- Péptido de unión

En la estructura de una inmunotoxina, los dominios marcador y tóxico están unidos por un

linker peptídico que debe ser estable en el entorno extracelular, pero que pueda ser

degradado en las vesículas de transporte, sin afectar al plegamiento o funcionalidad de ambos dominios (Dosio et al., 2011). Su degradación es un proceso clave en la translocación de la toxina al citosol. Por tanto, la longitud y composición de esta unión peptídica desempeña un papel fundamental en la eficacia de las inmunotoxinas. Entre los

linkers más utilizados consisten en una cadena de glicocola y serina ((G4S)3), ya que se ha demostrado que es estable en condiciones fisiológicas, pero que es susceptible de hidrólisis en el medio ácido de los endosomas y vesículas implicadas en el tráfico intracelular derivadas de orgánulos como el aparato de Golgi (Kreitman et al., 2001).

3.2.5.- Dominio tóxico

Como se ha descrito anteriormente, las toxinas que conforman el dominio tóxico deben ser altamente eficaces, específicas y su actividad debe conllevar la apoptosis celular. Por ello, destacan aquellas que propician la inactivación del ribosoma, y, por tanto, inhibiendo la biosíntesis proteica, lo que conlleva a la muerte celular programada (Allewine et al., 2015). Entre ellas se incluyen toxinas bacterianas, como la toxina diftérica y la exotoxina A de

Pseudomonas, que modifican e inactivan el factor de elongación 2 eucariota (eEF2), un

componente crítico de la maquinaria de síntesis proteica (Collier, 1967; Weldon & Pastan, 2011); y las ribotoxinas fúngicas, como α-sarcina, y las proteínas inactivadoras del ribosoma vegetales (RIP), como la ricina y la saponina (Stirpe et al., 1980; Walsh et al., 2013; Olombrada et al., 2017).

Debido a la alta especifidad de estas toxinas, junto a que la actividad del ribosoma es imprescindible para la supervivencia de las células eucariotas, provocan que los procesos de resistencia celular descritos son muy limitados. Entre ellos se comprende una liberación

ineficiente de la toxina al citosol (Du et al., 2008; Liu et al., 2013), un fallo en su mecanismo de acción (Wei et al., 2012) y una reducida promoción de la apoptosis (Mattoo et al., 2013).

3.3.- Aplicaciones

La conformación estructural de las inmunotoxinas les permite una gran versatilidad para su uso en distintitos tratamientos clínicos, ya que al introducir dominios marcadores con distintas afinidades les permite ser utilizadas frente a múltiples patologías. Entre sus aplicaciones se incluyen inmunotoxinas con actividad antiviral (Berger & Pastan, 2010; Spiess et al., 2016) y antiparasitaria (Li et al., 2011). Otra de las áreas donde destacan el uso de estos inmunoconjugados es en la modulación de la respuesta inmune: prevención en trasplantes de la enfermedad de injerto contra huésped (Stong et al., 1985; Vallera et al., 1996), la eliminación de células T de los injertos (Thompson et al., 1995; Weetall et al., 2002), la eliminación de células T reguladoras (Powell et al., 2007; 2008) y más recientemente, frente a la alérgenos o células implicadas en la respuesta alérgica (Lázaro- Gorines et al, 2019).

Sin embargo, es en las terapias antitumorales donde las inmunotoxinas han demostrado su potencial en multitud de ensayos in vivo, habiéndose seleccionado muchas de ellas para realizar ensayos clínicos (Kim et al., 2020; Allahyariet al., 2017). En la actualidad existen tres inmunotoxinas aprobadas como tratamientos por la FDA, estando dirigidas contra tumores sanguíneos, entre los que se encuentra Gemtuzumab ozogamicin, indicada para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda CD33 positivo en pacientes mayores de 2 años, utilizando N-acetil gamma calicheamicina como dominio toxico (Norsworthy et al., 2018). Denileukin diftitox (ONTAK) es otra inmunotoxina aprobada para su uso clínica, que utiliza el dominio tóxico modificado de la toxina diftérica dirigida frente a linfomas que sobreexpresan el receptor de la IL-2. (Wong et al., 2007). Por último, moxetumomab

pasudotox, compuesta por un scFv anti-CD22 fusionado a una forma truncada de la

exotoxina A de Pseudomonas, dirigida frente a la leucemia de células pilosas (HCL, hairy-

cell leukemia) (Kreitman et al., 2001 y 2018).

Por ahora, todas las inmunotoxinas aprobadas para terapia están dirigidas frente a cánceres hematológicos, ninguna para tumores sólidos, aunque existen varias terapias experimentales que en fases clínicas II-III para su aplicación en el tratamiento de tumores sólidos (Akbari et al., 2017; Allahyari et al., 2017; Li et al., 2017), entre las que destaca el diseño de inmunoconjugados basados en anticuerpos monoclonales ya probados para

su uso terapéutico, como el anticuerpo monoclonal Trastuzumab frente a cáncer de mama HER2-positivo (Verma et al., 2013; Von Minckwitz et al., 2019).