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Las RNasas extracelulares fúngicas han sido objeto de estudio por nuestro grupo de investigación desde hace más de 25 años, lo que han conducido a desarrollar la metodología que se necesita para la producción, caracterización y el estudio profundo de sus mecanismos de acción. A partir del conocimiento adquirido, surgió una nueva línea de investigación centrada en la utilización de esta familia de RNasas como constituyentes de dominio tóxico de inmunotoxinas antitumorales, y cuyos primeros resultados se recogieron en las tesis doctorales de los Doctores Nelson Carreras Sangrà y Jaime Tomé-Amat (Carreras-Sangrà, 2008; Tomé-Amat, 2012).

Todas estas RNasas se incluyen en la superfamilia de las Barnasas (Figura I14), donde destacan el grupo de las ribotoxinas, cuyo máximo exponente es la α-sarcina (Aspergillus

giganteus); y la familia de las ribonucleasas no tóxicas, entre las que destaca la RNasa T1

(Aspergillus oryzae,) (Yoshida, 2001; Wool, 1997).

Los miembros de esta superfamilia son proteínas de pequeño tamaño, formadas por una única cadena polipeptídica, con un plegamiento constituido por una lámina β antiparalela de cuatro hebras, un centro activo compuesto generalmente por la secuencia Glu-Arg-His. Además, el inhibidor de RNasas intracelular de células eucariotas no es capaz de interaccionar con ellas inhibiendo su actividad. Este aspecto es fundamental para el diseño de terapias antitumorales (Kim et al., 1995; Hofstenge, 1997).

Figura I14. Diagrama simplificado del árbol filogenético de la superfamilia de las Barnasas. Se indican de

forma orientativa las distancias filogenéticas entre las distintas ribotoxinas fúngicas, así como la especie productora de cada una de ellas. Adaptado de Herrero-Galán et al., 2008.

A continuación, se detallan las características estructurales y funcionales de las RNasas extracelulares fúngicas utilizadas en la construcción de inmunotoxinas por nuestro grupo de investigación.

4.1- Ribotoxinas

Las ribotoxinas son RNasas secretadas por hongos que se caracterizan por presentar una actividad ribonucleolítica altamente específica sobre el rRNA, provocando la inactivación de la actividad ribosómica, la inhibición de la biosíntesis proteica y la consecuente muerte celular vía apoptosis (Gasset et al., 1994; Kao et al, 2001; Martínez-Ruiz et al., 2001; Lacadena et al., 2007; Olombrada et al., 2017).

La primera ribotoxina en ser descrita fue la α-sarcina en 1963, producida por el hongo

Aspergillus giganteus, dentro de una investigación del departamento de salud de Michigan

centrada en la búsqueda de agentes anticancerígenos y antimicrobianos. Esta ribotoxina exhibía propiedades de inhibición del crecimiento tumoral en células de sarcoma y carcinomas inducidos en ratón (Olson & Goerner, 1965). A raíz de estos estudios, de han descrito más ribotoxinas con propiedades similares, producidas por el género aspergillus, como la restrictocina y mitogilina (A. restrictus) (Brandhorst & Kenealy, 1992; Kao et al., 2001; García-Ortega et al., 2005), Asp f 1 (A. fumigatus) , (Arruda et al., 1990 y 1992; Wool, 1997), gigantina (A. giganteus) (Wirth et al., 1997) o por otros géneros fúngicos como hirsutelina A (HtA) (H. thompsonii) (Herrero-Galan et al., 2008) y anisoplina (Metharizium anisopliae) (Lin et al., 1995; Martínez-Ruiz et al., 1999 b; Lacadena et al., 2007; Olombrada et al., 2017), mostrando todas ellas un porcentaje de identidad de secuencia cercano o superior al 90%.

Las ribotoxinas son proteínas básicas, formadas por alrededor de 150 aminoácidos y conteniendo dos puentes disulfuro conservados en todos los miembros de la familia (Rodríguez et al., 1982, Sacco et al., 1983; Lopez-Otín et al., 1984; Arruda et al., 1990; Wirth et al., 1997; Martínez-Ruiz et al., 1999 b; Lacadena et al., 2007; Carreras-Sangrá et al., 2008). Entre ellas existen diferencias en la secuencia de aminoácidos de los bucles con estructura no repetitiva y en la horquilla β del extremo amino terminal (Lacadena et al., 2007; Herrero-Galán et al., 2009) (Figura I15).

En cuanto a la estructura tridimensional, la α-sarcina (Pérez-Cañadillas et al., 2000 y 2002; García-Mayoral et al., 2005a y b) presenta un plegamiento mayoritario compuesto

por estructura α+β, con una lámina central antiparalela y una hélice de más de dos vueltas, y bucles con estructura no ordenada (Campos-Olivas et al., 1996a y b; Pérez-Cañadillas et al., 2000), con una función estructural e interacción con proteínas ribosómicas en el entorno del SRL (García-Ortega et al., 2002; García-Mayoral et al., 2005 b).

Los bucles periféricos, especialmente el bucle 2, son esenciales para su actividad y por ello se encuentran conservados los residuos 52-55 en todas las RNasas fúngicas extracelulares (Mancheño et al., 1995; Siemer et al., 2004). Por otro lado, mediante los residuos 51 y 55, este bucle interacciona específicamente con el nucleótido de guanina prominente del SRL, situado en las proximidades del enlace que es hidrolizado significativo del SRL (Pérez-Cañadillas et al., 2000; Yang et al., 2001).

El centro activo, estructuralmente, forma parte de la lámina b antiparalela. Destacan tres residuos que participan directamente en la catálisis ácido-base, implicados en la transferencia de electrones: His 50, Glu 96 e His 137 (Lacadena et al., 1999; Martínez- Ruiz et al., 2001). Los valores de pKa de estos residuos son poco frecuentes, así como las formas tautoméricas de las histidinas, encontrándose conservados en todas las RNasas microbianas. Además, el enlace de hidrógeno que forma la His 137 con el bucle 5 es esencial para la actividad catalítica de la molécula.

La principal característica que hace de las ribotoxinas unas RNasas con especial interés es su capacidad para inhibir la biosíntesis de proteínas, debido a su actividad ribonucleolítica específica hidrolizando un único enlace del RNA ribosomal de mayor

Figura I15. Estructuras tridimensionales de las ribotoxinas restrictocina, α-sarcina, hirsutelina A, y de las

es una secuencia universalmente conservada, que desempeña un rol crucial para la función ribosomal durante su interacción con los factores de elongación EF-tu/EF-1 y EF- G/EF-2 (García-Ortega et al., 2010; Shi et al., 2012).Debido a que este sitio es una diana para distintos inhibidores de la actividad ribosómica, es conocido como el lazo sarcina- ricina (SRL, Sarcin-Ricin Loop) (Figura I16) (Nielsen y Boston, 2001; Peumans et al., 2001). El reconocimiento de la misma está basado en la interacción de la ribotoxina con el tetrabucle GAGA ribosómico (Glück y Wool, 1996; Pérez-Cañadillas et al., 2000), aunque requiere de la interacción de la horquilla β amino terminal y del bucle 2 con las proteínas ribosomales L14 y 6, respectivamente (García-Mayoral et al., 2004 y 2005b, Lacadena et al., 2007).

Además, la especificidad de su actividad enzimática sobre el SRL provoca la liberación del denominado fragmento α, de aproximadamente 490 bases en ribosomas eucariotas, pudiendo ser cuantificado mediante técnicas de biología molecular (Kao et al., 2001; Martínez-Ruiz et al., 2001). El mecanismo catalítico de las ribotoxinas es del tipo ácido- base, con la formación de un intermediario cíclico (Lacadena et al., 1998). En la α-sarcina, la catálisis es llevada a cabo principalmente por los aminoácidos conservados de la triada del centro activo, siendo la His 137 y el Glu 96 los que actúan como ácido y base general durante el proceso, mientras que la Arg 121 participa en la orientación del sustrato. (Lacadena et al., 1998, 1999). Otros aminoácidos con funciones clave son la His 50, en la estabilización del intermediario de reacción (Lacadena et al., 1999), Leu 145, para

Figura I16. Diagrama mostrando la localización y estructura del SRL en el ribosoma. A) Posición del SRL

dentro de la subunidad mayor del ribosoma de Escherichia coli, así como las proteínas conservadas que rodean al SRL: uL6, uL11 y uL14 (PDB ID: 2AW4). B) Estructura del SRL destacándose el tetrabucle GAGA, donde se señala el enlace que es hidrolizado por las ribotoxinas (G 2661/A 2662) y la adenosina (A 2660) eliminada por la ricina. Adaptado de Olombrada et al., 2017.

mantener el pKa óptimo de la His137 (Masip et al., 2001) y la Tyr 48, con una actividad necesaria, pero sin ser aún descrita (Álvarez-García et al., 2006) (Figura I17).

Por otro lado, otra de las principales propiedades de las ribotoxinas es su capacidad de atravesar membranas lipídicas, sin que se conozca un receptor que medie en este proceso (Gasset et al., 1994; Kao et al., 2001). Este proceso se ve favorecido en células que tienen alterada la permeabilidad de su membrana y en aquellas ricas en fosfolípidos ácidos (Gasset et al., 1994; Connor et al., 1989; Turnay et al., 1993, Olmo et al., 2001), debido al carácter básico de las ribotoxinas.

De esta manera, la actividad citotóxica de una ribotoxina consistiría en dos pasos: En primer lugar, la interacción con la membrana celular para internarse al citosol, que constituiría la etapa limitante, para, en segundo lugar, ejercer su acción ribonucleolítica sobre el RNA ribosomal, inactivando el ribosoma, y consecuentemente inhibiendo la biosíntesis de proteínas, que conlleva la muerte celular vía apoptosis (Turnay et al., 1993; Olmo et al., 2001).

Dentro de las ribotoxinas, aquella que ha demostrado ser más efectiva como

dominio tóxico de las inmunotoxinas es la α-sarcina, de acuerdo a las características mencionadas anteriormente, habíendose descrito en diferentes diseños de inmunotoxinas antitumorales (Wawrzynczak, et al., 1991; Rathore et al., 1997; Rathore & Batra, 1997a; Carreras-Sangrà et al., 2012; Tomé-Amat et al., 2015b; Jones et al., 2016; Lázaro- Gorines et al., 2019) (Figura I17).