Generalmente existen dos fuentes de fibrina humana: la fibrina comercial de los pegamentos tisulares y la fibrina obtenida a partir del plasma (Law et al., 2017).
Los problemas derivados del empleo de la fibrina comercial de los pegamentos tisulares es la necesidad de emplear múltiples unidades de crioprecipitados de fibrinógeno y fibronectina combinados con varios factores para proporcionar la superficie dérmica necesaria, con lo cual el riesgo de transmisión de enfermedades víricas aumenta [particularmente la hepatitis B y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)] (Currie et al., 2001), aunque este riesgo se reduce debido al cribado de donantes, al tratamiento de inactivación viral por calor, y el uso de detergentes para inactivar los lípidos de los virus envueltos trasmitidos por la sangre en los derivados de plasma, lo que hace que estos productos sean seguros (Park et al., 2012). Los productos de un solo donante mejoran el margen de seguridad. Aunque se ha demostrado con ensayos clínicos que son productos seguros, algunas fibrinas comerciales de los pegamentos tisulares contienen aprotinina y trombina bovina existiendo un riesgo teórico de transmisión de alguna variante de la enfermedad de Creutzfeldt- Jakob desde estas fuentes.
La otra fuente de fibrina, a partir del plasma, si es autóloga se evita el riesgo de transmisión viral y son más seguras, siempre que no se utilice trombina o aprotinina exógena. Fibrinógeno Fibrina estable Factor XIII Trombina Trombina Factor XIIIa Fibrina
inestable
Ca2+ Ca2+ Fibropéptidos A y B Fibropéptidos A y B45
Actualmente, la fibrina comercial de los pegamentos tisulares es la principal fuente de fibrina usada. Consiste en un conjunto de crioprecipitados de fibrinógeno y fibronectina combinados con factor XIII y aprotinina, que se añaden a la trombina y al calcio (Currie et al., 2001; Ye et al., 2000). Se sintetizan por la centrifugación de la sangre en un tubo citrado y recogiendo el plasma, que contiene el fibrinógeno en baja concentración. El incremento de esta concentración se puede llevar a cabo concentrando el fibrinógeno de un solo donante o mezclando el fibrinógeno de varios donantes hasta una concentración final de 60-115 mg/mL que se considera la adecuada (Kober et al., 2015) dando lugar a la elevada fuerza tensil y fuerte adhesión, propiedades que no son esenciales para su uso como soporte (Law et al., 2017).
Los beneficios del pegamento tisular como adhesivo se hicieron evidentes en los modelos animales cuando se roció en el lecho de la herida antes de la deposición de la lámina de epitelio comparado con el grupo control en el cual no se utilizó. Una semana después del trasplante, el porcentaje de injerto fue superior. Sin embargo, los análisis inmunohistoquímicos y ultraestructurales mostraron que la evolución de la epidermis humana cultivada después del trasplante fue similar en ambos grupos (Currie et al., 2001). Posteriormente, Ronfard et al., (1991) y Pellegrini et al., (1999) desarrollaron la técnica de cultivar láminas de epitelio autólogas de la misma forma que Rheinwald y Green, (1975) pero sobre el pegamento tisular de fibrina in vitro, sin observar la destrucción de la fibrina en 15 días, probablemente por el uso de aprotinina, mientras que los queratinocitos seguían crecieron hasta la confluencia y sintetizaron una membrana basal. Así, a partir de una biopsia de piel de 4,5 cm2 obtuvieron 4,1 m2 de equivalente de piel comparados con los 1,4 m2 obtenidos cuando los cultivaron en superficies de plástico.
Una de las ventajas de estos equivalentes de piel es la eliminación del uso de dispasa para despegarlos del frasco de cultivo que reduciría la expresión de antígenos de superficie de los queratinocitos y como consecuencia su potencial adhesivo, aumentando así la tasa de injerto en un 20% (Currie et al., 2001). El uso de la fibrina comercial de los pegamentos tisulares con queratinocitos, no solamente mantiene a los queratinocitos proliferativos sino que también proporciona un medio óptimo para su migración, proliferación y diferenciación, facilitando la manipulación de las láminas de epitelio que hasta entonces eran muy frágiles (Kaiser et al., 1994).
Posteriormente, el siguiente paso fue añadir fibroblastos a la matriz de fibrina. Meana et al., (1998) sintetizaron de esta forma una matriz con fibroblastos para el cultivo de los queratinocitos mejorando así su proliferación y lograron unos equivalentes de piel que una vez trasplantados en un modelo animal, injertaron adecuadamente logrando sintetizar una membrana basal ausente en otros modelos.
Recientemente, Yang et al., (2014) utilizaron una mezcla de pegamento tisular de fibrina con células madre de la mé dula ósea alogénicas para crear un apósito que formó rápidamente un gel sobre las heridas de los quemados. Mehanna et al., (2015) también usaron el mismo modelo pero para tratar heridas crónicas, encontrando una mejora
46
significativa con respecto a la calidad funcional e histológica de los equivalentes de piel, evaluada a través de su función de barrera epidérmica así como de las propiedades mecánicas dérmicas.
El uso de plasma como fuente de fibrina representa una serie de grandes ventajas respecto a la fibrina comercial de los pegamentos. El plasma se obtiene simplemente por fraccionamiento directo de la sangre completa, siendo fácil de procesar y pudiendo ser totalmente autólogo (eliminando el riesgo de transmisión viral) (Llames et al., 2006). Además, el plasma solamente requiere la adición de calcio para coagular y formar la matriz de fibrina, mientras que la preparación de las matrices de fibrina a partir de los pegamentos tisulares es más laborioso, consume más tiempo y es más caro (aproximadamente para 5 ml el coste es de 2500 $) (Park et al., 1999).
Esta matriz de fibrina sintetizada a partir de la fibrina del plasma, comprende una red de poros interconectados, donde el fibrinógeno es el factor más importante en cuanto a la estructura porosa. La concentración fisiológica de fibrinógeno se encuentra en torno a 1-5 mg/mL y la concentración de fibrinógeno adecuada para asegurar una buena incorporación, adherencia, y proliferación de los fibroblastos que a su vez afecta a la migración celular, proliferación y diferenciación de los queratinocitos se encuentra entre 2-3,5 mg/mL (de la Puente et al., 2011). Con este modelo, a diferencia del cultivo de láminas de epitelio por el método de Rheinwald y Green, (1975), los queratinocitos cultivados in vitro sobre la matriz de fibrina en un estado no confluente y luego liberándolos en la herida puede reducir el tiempo necesario de cultivo de las láminas de epitelio. Esto tiene la ventaja de proporcionar queratinocitos que no han sufrido cambios fenotípicos asociados con la inhibición por contacto y por tanto no deberían tener disminuido el potencial adhesivo ni proliferativo. También se evita el uso de dispasa. Estas láminas cultivadas pueden ser trasplantadas, manipularse y extraerse del frasco de cultivo manteniendo su integridad. También presenta otras ventajas con respecto a las anteriores como el empleo como coagulante de la trombina endógena presente en el plasma, la posibilidad de sustituir el antifibrinolítico de origen bovino por otros de origen sintético y la posibilidad de realizar una gran superficie de equivalentes dérmicos a partir de una simple y única donación a partir de un solo donante o paciente. Este plasma no solo aporta las proteínas estructurales de la matriz sino que también contiene algunas moléculas que ayudan a la adhesión celular, tales como fibronectina (necesarias para que los fibroblastos puedan fijarse a la matriz e iniciar sus funciones fisiológicas), es un reservorio para factores de crecimiento, plaquetas, citoquinas y enzimas, que pueden promover la proliferación de los fibroblastos y queratinocitos, estimular y acelerar la curación del tejido e incluso la adipogénesis (Kober et al., 2015).
También se ha demostrado que aunque tanto el soporte de colágeno como el de fibrina proporcionan similares ambientes en los cuales los queratinocitos y fibroblastos pueden proliferar in vitro, la concentración de VEGF en el medio de cultivo en la matriz de fibrina es significativamente mayor que el soporte de colágeno. Este incremento de
47
VEGF no se debe al mayor número de células, sino a que los productos de degradación de la fibrina, componentes clave del coágulo, intrínsecamente estimulan la actividad angiogénica induciendo la secreción de este factor (Whelan et al., 2014; Feng et al., 2013; Huang et al., 2005) por las células. Esto es importante ya que la angiogénesis proporciona factores tróficos e incluso ayuda a la regeneración del sistema nervioso (Hojo et al., 2003).
Con el trasplante del equivalente de piel basado en la matriz de fibrina en humanos, éste mostró una excelente adhesión al lecho de la herida y proporcionó un soporte para la proliferación de la lámina de epitelio con la emergencia de células endoteliales vasculares en el trasplante después de tres días. Además la infiltración de células inflamatorias fueron bajas cuando lo compararon con la matriz de colágeno (Hojo et al., 2003).