caracterización de poblaciones celulares con propiedades de células madre/progenitoras a partir de la MA (Parolini et al., 2008). Estas células pueden ser epiteliales o mesenquimales según se aíslen desde el epitelio o desde las láminas mesenquimales, respectivamente (Miki et al., 2010; Murphy et al., 2010; Marongiu et al., 2010; Díaz-Prado et al., 2010a). Las células epiteliales derivan del ectodermo y las células mesenquimales derivan del mesodermo por lo tanto, tienen diferente origen embriológico. En 2007, la “International Placenta Stem Cell Society” ha unificado la nomenclatura de estas células (Lindenmair et al., 2012), denominándolas CEA y CMEA respectivamente. Ambas poblaciones son fáciles de aislar y presentan características que las hacen candidatas para su utilización en Terapia Celular.
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5.1. Caracterización inmunofenotípica de las células aisladas de la Membrana Amniótica
La caracterización inmunofenotípica de las CMEA muestra la presencia de los marcadores de células madre mesenquimales (CMM) bien definidos (CD90, CD44, CD73, CD166, CD105 y CD29), descritos para la médula ósea con la ausencia de los marcadores hematopoyéticos (CD34 y CD45) y la falta concomitante de marcadores de monocitos (CD114), macrófagos (CD11) y marcadores de fibroblastos (Abdulrazzak et al., 2010; Insausti et al., 2010; Kobayashi et al., 2008; Mihu et al., 2009). Las CMEA también expresan bajos niveles de HLA-ABC, pero no expresan HLA-DR, indicando que pueden ser útiles en procedimientos de trasplante clínico (Parolini et al., 2009).
Las CEA son positivas para desmina y vimentina (Toda et al., 2007) y también para los mismos marcadores propios de CMM que las CMEA (Díaz-Prado et al., 2010a). Ilancheran et al., (2007) demostraron que las CEA expresan marcadores de superficie que están normalmente presentes en las CME y células germinales, tales como el antígeno embrionario específico del estadío 3 (SSEA3), SSEA4, antígeno de rechazo tumoral (TRA-1-60) y TRA-1-81 y otros antígenos tales como el miembro de la superfamilia de cassettes de unión al ATP/proteína de resistencia al cáncer de mama (ABCG2/BCRP), CD9, CD24, E-cadherina e integrina α y β (Niknejad et al., 2008; Insausti et al., 2010). Estas CEA también expresan factores de transcripción específicos para células pluripotenciales tales como la proteína de unión al octámero (Oct4), Nanog, Sox- 2 (SRY-related HMG-box gene 2) y Rex-1 (Parolini et al., 2009; Miki et al., 2007, 2005). Las CMEA también son positivas para estos marcadores de pluripotencia (Kim et al., 2014), pero la positividad para marcadores de CME, como SSEA-3 o SSEA-4, sigue siendo debatida (Parolini et al., 2009; Bilic et al., 2008; Ueno et al., 2006). En cultivo, los fenotipos de ambas poblaciones celulares se mantienen desde el pase P0 hasta el pase P9 (Díaz-Prado et al., 2010a).
5.2. Potencial de diferenciación de las células aisladas de la Membrana Amniótica
La pluripotencia de las células derivadas de la MA la han demostrado varios científicos empezando por Tamagawa et al., (2004) siendo corroborada por estudios posteriores en donde demuestran la capacidad de estas células de diferenciarse in vitro
hacia células de los tres linajes germinales (Insausti et al., 2010; Ilancheran et al., 2007; Miki et al., 2005).
Las CMEA presentan el fenotipo de las células progenitoras neuronales antes de cultivarlas en medio de inducción neural y la capacidad de diferenciarse hacia células similares a neuronas (linaje ectodérmico). La nestina y Musashi1 (células progenitoras neuronales) se expresan en las CMEA indiferenciadas pero su expresión se incrementa significativamente después de la inducción. Lo mismo sucede con TuJ 1, NF-medio, GFAP
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(Bilic et al., 2008; Toda el al., 2007), enolasa específica de neuronas y proteína asociada a los microtúbulos después de su cultivo en medio de inducción neural específico (Tamagawa et al., 2008; Kim et al., 2007; Portmann-Lanz et al., 2006; Sakuragawa et al., 2004).
Tamagawa et al., (2007) mostraron que las CMEA fueron capaces de diferenciarse a células con características de hepatocitos (linaje endodérmico). Las CMEA expresaron ARN hepatocítico típico, tal como el de la albúmina, K18, α- fetoproteína, 1-antitripsina y el del factor nuclear de hepatocitos (HNF-4) pero después de la inducción in vitro sólo expresaron el de la glucosa-6-fosfatasa, ornitina transcarbamilasa y almacenamiento de glucógeno.
En cuanto a la diferenciación de CMEA hacia el linaje mesodérmico, In´t Anker et al., (2004) demostraron el potencial osteogénico y adipogénico. Después de la diferenciación osteogénica las CMEA sufrieron cambios morfológicos y mostraron depósitos de calcio cuando fueron teñidas con von Kossa. Por otro lado, después de diferenciación adipogénica, las CMEA se convirtieron en células con múltiples vacuolas que se tiñeron con Oil Red O. Posteriormente, Portmann-Lanz et al., (2006) mostraron la capacidad de diferenciación de estas células hacia los linajes condrogénicos y miogénicos. La diferenciación condrogénica la demostraron por la presencia de abundante colágeno en la MEC por medio de la tinción de azul alcián y la diferenciación miogénica la demostraron al determinar la expresión de factores de transcripción miogénicos tales como Myo D y Myogenin y la expresión proteica de desmina en las CMEA cultivadas en el medio de diferenciación. Alviano et al., (2007) confirmó estos resultados y fue el primero en demostrar el potencial de diferenciación angiogénico de estas células. Este último estudio reveló que las CMEA, después del cultivo en los medios de inducción con VEGF, expresaron marcadores endoteliales específicos tales como el receptor del VEGF, así como la aparición de CD34 y del factor von Willebrand.
En cuanto al potencial cardiomiogénico (linaje mesodérmico), las CMEA expresaron después de la inducción cardiomiogénica genes específicos cardíacos tales como GATA4, MLC-2a (cadena ligera de la miosina), MLC-2v, cTnI y cTnT (Tanaka et al., 1999; Zhao et al., 2005). Zhao et al., (2005) mostraron tras el trasplante de las CMEA en los corazones de ratas con infartos de miocardio, que estas CMEA sobrevivieron en el tejido cicatricial durante 2 meses y se diferenciaron en células similares a cardiomiocitos.
Las CEA poseen características de las células progenitoras neurales expresando algunos marcadores de diferenciación de células madre neurales, neuronas y células gliales tales como nestina, ácido glutámico descarboxilasa, GFAP y nucleótido cíclico fosfodiesterasa (Miki et al., 2005). Elwan et al., (2003) y Kakishita et al., (2000), demostraron la diferenciación de las CEA hacia células neurales con capacidad para sintetizar y liberar acetilcolina, catecolaminas y la dopamina, sugiriendo su posible utilidad en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (Parolini et al., 2008).
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La diferenciación hepática de las CEA fue descrita también por Sakuragawa et al., (2000). Estos investigadores demostraron que las CEA cultivadas producían albúmina y α-fetoproteína y las identificaron integradas en el parénquima hepático de ratones con inmunodeficiencia combinada severa, tras el trasplante de CEA en el hígado. Estudios posteriores demostraron que estas CEA también muestran otras propiedades funcionales asociadas con hepatocitos, tales como almacenamiento de glucógeno y expresión de factores de transcripción enriquecidos en el hígado, como el HNF y varios genes metabolizantes de los fármacos (citocromo P450) (Miki et al., 2005; Takashima et al., 2004; Davila et al., 2004).
La diferenciación de las CEA a otro linaje endodérmico, el pancreático, también fue descrito. Wei et al., (2003) cultivaron estas CEA en presencia de nicotinamida para inducir la diferenciación pancreática y observaron la expresión de insulina.
La diferenciación de CEA a células cardíacas se evaluó por primera vez por Miki et al., (2005). Después de inducir la diferenciación de las CEA se detectó un patrón de tinción de α-actinina muy similar al de los cardiomiocitos derivados de las CME, y de los factores de transcripción GATA-4 y Nkx 2.5.
La diferenciación de las CEA a otro linaje mesodérmico la describió Ilancheran et al., (2007), quienes mostraron que las CEA pueden diferenciarse en células con un fenotipo y marcadores característicos de los miocitos, osteoblastos y adipocitos.