Este análisis se realiza sobre los datos de genes normalizados y se agruparon en base a su perfil de comportamiento con el programa maSIGpro, que usa un análisis de regresión lineal para modelar la expresión génica.
Se realizó un análisis secuencial para todos los tratamientos (1: concentración baja y 2: concentración alta) a tiempo temprano y tardío (5 y 15 días). Se obtuvo así una clasificación de los genes según 4 patrones de expresión. No todos los genes están incluidos en los cuatro grupos, ya que este programa clasifica los genes más representativos en cada caso. Generamos en concreto 4 grupos o clusters, que muestran 4 comportamientos distintos (Figura 23):
En el grupo 1 se incluyen 595 genes en el tratamiento 2 con un valor promedio de expresión génica que aumenta más de 100 veces a los 5 días y 78 veces de expresión en el tratamiento 1. Luego decaen a los 15 días.
En el grupo 2, se incluyen 3.125 genes que se encuentran reprimidos en ambos tratamientos.
En el grupo 3, se agrupan 2.229 cuya expresión aumenta con el tiempo. En este grupo se encuentran por tanto los genes más expresados en ambos tiempos y tratamientos. Destaca el aumento considerable de expresión en el tratamiento 2. En el grupo 4, se incluyen 2.054 genes cuya expresión aumenta inicialmente respecto al control pero luego disminuye. En el caso del tratamiento 2 pasan de 85 a 75, y en el tratamiento 1 de 55 a 50.
93
Figura 23. Patrones de expresión detectados por el programa maSIGpro. El color rojo representa el tratamiento 1 (50 mg/L de Aroclor) y el verde el tratamiento 2 (200 mg/L de Aroclor).
La clasificación funcional de los transcritos que presentaron un patrón de regulación positivo, ubicados en el grupo 3, nos ayudó a entender el conjunto de genes implicados en la respuesta a PCBs. Las funciones moleculares más significativas aparecen en color rojo. Le siguen el color naranja y el amarillo. Las más interesantes para nuestros objetivos serían: actividad catalítica, actividad oxido-reductasa, actividad hidrolasa, actividad fosfatasa, actividad ATPasa, unión a iones, transporte y función de regulación transcripcional. Así, cuando comparamos el efecto de la concentración y el tiempo de tratamiento con su correspondiente control, vemos que los procesos catabólicos, el transporte y óxido-reducción son las anotaciones más significativas. Las categorías que están más sobre-expresadas se observan en la Figura 24.
A su vez se generaron heat maps representando los niveles de expresión génica clasificada por sus categorías funcionales más expresadas. Fueron elegidas las
0 5 15 0 5 15 0 5 15 0 5 15 100 90 80 70 90 80 70 60 90 80 70 60 50 40 80 75 70 65 60 55 Grupo 1 Grupo 4 Grupo 3 Grupo 2 Tiempo Perfil de 595 genes Tiempo Perfil de 3125 genes Tiempo Perfil de 2229 genes Tiempo Perfil de 2054 genes V al o r p ro me d io d e ex p re si ó n V al o r p ro me d io d e ex p re si ó n
Resultados
94
categorías más relevantes del análisis de RNA-seq. Dicha relevancia se debía a su alta expresión y posible candidatura en la ruta de degradación de PCBs. Los genes comprendidos en estas categorías están listados y organizados de acuerdo al tratamiento y valor de inducción. Las categorías de la anotación correspondiente a función molecular son: transporte, compuestos orgánicos cíclicos, actividad monooxigenasa y actividad catalítica. El heat map incluye el nombre y función del gen. Las escalas se encuentran al costado izquierdo de cada mapa. El color depende del nivel de expresión y sigue una escala bi o tricolor, verde (baja expresión) (datos no mostrados), negro (expresión media) y rojo (alta expresión) (Figura 25 A y B). En el caso de la actividad de transporte demuestra que el tratamiento donde se realizó de manera notable una sobreexpresión mayor que el resto de los tratamientos es el tratamiento a 200 mg/L 15 días (1 vs 5), donde se hacen notar transportadores como ABC_MDR, transportadores de aminoácidos, transportadores de cationes y canales de cloro.
En el caso de la actividad de orgánicos cíclicos la participación del citocromo P450 (Potri.008G099100.1), del factor de transcripción bZIP (Potri.008G106700.1), y varios factores de transcripción que mantienen una expresión mayor a los 15 días. La actividad monooxigenasa está muy bien representada en los cuatro tratamientos. Sin embargo, la actividad funcional más representada y con un valor de expresión mayor es la actividad catalítica. En esta categoría destacan las actividades glutatión transferasa, short chain deshidrogenasa, UDP glucosil tansferasa, peroxidasa, quitinasa y tioredoxina, entre otras.
95
Figura 24. Términos GO de función molecular para los genes expresados diferencialmente usando un modelo de distribución y una corrección de Bonferroni (p-value < 0,05). Un E-value ≤ 1E-05 fue considerado como significativo. Control vs. 200 mg/L a 15 días.
Resultados
96
Figura 25A. Agrupamiento de los genes expresados diferencialmente en los cuatro tratamientos según su clasificación GO: Funciónes moleculares: A) Transporte, B) Compuestos orgánicos cíclicos, C) Monooxigenasa y D) Actividad catalítica. Heat map incluye el nombre y la función del gen. Las escalas se encuentran en la parte superior de cada mapa. El color depende del nivel de expresión y sigue una escala bi o tricolor : verde (baja expresión) (datos no mostrados), negro (expresión media) y rojo (alta expresión).
A)
B)
Transporte
97
Figura 25 B. Agrupamiento de los genes expresados diferencialmente en los cuatro tratamientos según su clasificación GO: Funciónes moleculares: A) Transporte, B) Compuestos orgánicos cíclicos, C) Monooxigenasa y D) Actividad catalítica. Heat map incluye el nombre y la función del gen. Las escalas se encuentran en la parte superior de cada mapa.El color depende del nivel de expresión y sigue una escala bi o tricolor : verde (baja expresión) (datos no mostrados), negro (expresión media) y rojo (alta expresión).
D) C)
Monooxigenasa
Resultados
98
La interpretación biológica de los genes expresados diferencialmente se completó aún más mediante el análisis de las rutas metabólicas KEGG (Figura 26). Se muestran las 11 anotaciones más representativas: biosíntesis de flavonoides, estilbenoides, diarilheptanoides y gingerol; benzoxazinoides; flavonas y flavonoles;
transportadores ABC; antocianinas; carotenoides; isoflavonoides, tirosina,
ubiquinona y otros terpenoides.
Figura 26. Análisis KEGG de enriquecimiento de rutas metabólicas de los transcritos expresados diferencialmente. Se representan once categorías con un valor de p <0,05. Se representan dos comparaciones Control vs. 50 mg/L y Control vs. 200 mg/L a los 15 días.