Preparation of the participants for the process of data collection

Para determinar las cinéticas de unión y la afinidad de las proteínas TIM murinas por FS usamos la técnica de resonancia de plasmones de superficie (SPR) (11, 12, 19). Mediante el uso del instrumento BIAcoreTM 3000 y chips L1 (GE Healthcare) se pudo monitorizar la unión de los dominios IgV solubles de las proteínas mTIM a superficies con liposomas de FS y FC y determinar sus afinidades, tal y cómo se explica en

Materiales y métodos.

Se realizaron varios tipos se experimentos donde se ensayaron superficies con diferentes cantidades y composición de liposomas inmovilizados en el chip. Inicialmente utilizamos superficies homogéneas que contenían exclusivamente liposomas de FS o de FC. Con estas superficies observamos unión específica de TIM-1 a FS y una unión marginal a FC (Fig. 4.36A). Por lo tanto, en todos los experimentos se utilizó una superficie de FC en la celda 1 del chip L1 como control. Así mismo, la cantidad de proteína unida dependió de la cantidad de FS inmovilizada en el chip (Fig. 4.36B). No se observó unión de la proteína a FS inmovilizada en ausencia de calcio (Fig. 4.36C), confirmando que la interacción en el BIAcore era dependiente de catión. Por este motivo, la regeneración de la superficie se realizó mediante la inyección de tampón Hepes con 25 mM de EDTA.

Tras observar una interacción específica entre el dominio N-terminal de las proteínas TIM con FS en el BIAcore, tal y como habíamos observado con proteínas TIM-Fc solubles y liposomas inmovilizados en placa, decidimos usar esta técnica para determinar la afinidad y las cinéticas para la interacción monomérica de las proteínas murinas de la familia TIM con FS. Utilizamos los dominios IgV de las proteínas nativas replegados in

vitro, así como proteínas mTIM-4 mutantes que carecían de residuos implicados en la

coordinación del metal (mTIM-4 ND/AA) o de los residuos hidrofóbicos de la zona superior del lazo FG (mTIM-4 FW/AA), residuos fundamentales para la unión de FS (Fig. 4.37). Inicialmente observamos que mTIM-1 y mTIM-4 se unían de manera similar a una superficie con FS, mientras que la unión de mTIM-3 era significativamente menor (Fig. 4.37). Tanto la asociación como la disociación de las proteínas al chip con FS eran relativamente rápidas. Por el contrario, mTIM-2 y el mutante mTIM-4 FW/AA no se unían a la superficie de FS, aunque sí observamos cierta unión del mutante mTIM-4 ND/AA (Fig. 4.37). No obstante, este mutante mostraba una disociación relativamente

lenta, comparada con la observada para las demás proteínas, lo que podría ser indicativo de agregación.

Para la determinación de las cinéticas de unión de las proteínas TIM a FS en el BIAcore, realizamos experimentos en los que se inyectaron las proteínas a concentraciones de entre 200 y 6000 nM (Fig. 4.38). También se realizaron experimentos a diferentes flujos (10, 30 y 60 µl/min) y con diferentes superficies, que diferían tanto en la composición como en la cantidad de FS inmovilizada (Fig. 4.36C).

mTIM-1 Tampón' C Tiempo (seg) R e sp u e st a (R U ) mTIM-1 A FS FC mTIM-1 Tampón' EDTA' Asociación' Disociación' Regeneración' R e sp u e st a (R U ) Tiempo (seg) mTIM-1 Tampón' B R e sp u e st a (R U ) Tiempo (seg)

Figura 4.36. Interacción de las proteínas TIM murinas con liposomas de FS en el BIAcore. A. Unión de mTIM-1 (6 µM) a superficies con liposomas de FS (azul) y de FC (gris) inmovilizados en un chip L1. Sensogramas monitorizados en tiempo real, que muestran la señal (Respuesta, RU) durante las fases de asociación y disociación de la proteína a las superficies y de regeneración de las mismas. Se indica el momento de inicio (TIM-1) y finalización (Tampón) de la inyección de la proteína. Los experimentos se realizaron con tampón Hepes-salino con 2,5 mM CaCl2 y la regeneración

con tampón Hepes-salino que contenía 25mM de EDTA. B. Sensogramas monitorizados durante la inyección de la proteína mTIM-1 (2 µM) a través diferentes tipos de superficies de FS. La cantidad (RU) y composición de los liposomas inmovilizados en cada caso se muestra en la leyenda. C. Sensogramas obtenidos durante la inyección de mTIM-4 (4 µM) a liposomas de FS en tampón Hepes-salino con 2,5 mM de CaCl2 (azul) o sin calcio (gris).

El procesado de los datos y el ajuste de las curvas a los diferentes modelos de interacción se llevó a cabo con el programa Bievaluation v3.2 (66). El ajuste de los sensogramas a una interacción tipo 1:1 (Langmuir binding) fue mejor en los casos en los que se inmovilizó menor cantidad de liposomas o liposomas de composición mixta. La interacción a FS detectada a altas concentraciones de mTIM-1 (2 µM, 4 µM y 6 µM) no ajustaba adecuadamente a un modelo de interacción tipo 1:1, por lo que estas curvas no fueron incluidas en los cálculos de las cinéticas de unión. Las curvas correspondientes a concentraciones elevadas de mTIM-1 no alcanzaban un estado estacionario como en el caso de mTIM-3 o mTIM-4. A altas concentraciones de mTIM-1 aparecía un segundo tipo de interacción, posiblemente debida a interacciones homofílicas TIM1-TIM1 o a problemas de agregación de la muestra.

Figura 4.38. Interacción de las proteínas TIM con FS en el BIAcore. Se muestran sobrepuestos los sensogramas obtenidos durante la inyección de mTIM-4 a las concentraciones indicadas en la leyenda.

mTIM-4 Tampón' Tiempo (seg) R e sp u e st a (R U )

Figura 4.37. Interacción de las proteínas TIM murinas con FS en el BIAcore. Sensogramas monitorizados durante la asociación y disociación de las proteínas indicadas de una superficie con liposomas de FS inmovilizados.

Tampón' Proteína Tiempo (seg) R esp ue st a (R U )

Los valores de las constantes cinéticas para la interacción monomérica de mTIM-1 y mTIM-4 con FS fueron muy similares, tal y como podíamos esperar de proteínas con un MILIBS tan similar. Ambas proteínas presentan constantes cinéticas de asociación y de disociación relativamente altas. Sus afinidades son del orden de 320 a 400 nM (Tabla 4.3), que podríamos calificar de moderadas. La menor afinidad determinada para mTIM-3, 1080 nM, es consistente con experimentos anteriores y viene determinada por una constante de asociación significativamente menor (Tabla 4.3). Por el contrario, su constante de disociación es de un rango similar al determinado para mTIM-1 y mTIM-4. Por lo tanto, mTIM-3 parece unirse con mayor dificultad a FS, posiblemente debido a una menor accesibilidad de su MILIBS.

Para conocer los parámetros termodinámicos de la interacción de las proteínas TIM con FS realizamos los experimentos de unión a diferentes temperaturas en el BIAcore, con objeto de determinar la variación de las constantes cinéticas de asociación y disociación en función de la temperatura. Los experimentos se llevaron a cabo a dos flujos (10 µl/min y 30 µl/min) y a temperaturas de 15ºC, 25ºC, 30ºC y 37ºC. Cuando realizamos los experimentos de unión a diferentes temperaturas, observamos que la unión (RU) de las proteínas TIM a superficies con FS se veía disminuida a mediada que aumentábamos la temperatura del proceso (Fig. 4.39A). El cálculo de las constantes cinéticas mostró una disminución de la constante de asociación y un aumento de la constante de disociación con la temperatura, que por lo tanto provoca una disminución de la afinidad de las proteínas TIM por FS (Fig. 4.39B).

Tabla 4.3. Afinidad y cinética de la interacción de las proteínas TIM con liposomas de FS. Afinidad y constantes cinéticas de asociación (kaso) y disociación (kdis) para la interacción de los dominios IgV de las proteínas TIM con FS determinadas en el BIAcore. Se muestra el valor medio y la desviación estándar correspondiente a 3 tipos diferentes de experimentos.

kaso x10-5 _(M-1 _s-1_{) kdis x10}1 _{( s}-1_{) KD x10}6 _M mTIM-1 2,8 ± 0,2 4,8 ± 0,8 0,32 ± 0,05 mTIM-2 -- -- -- mTIM-3 0,8 ± 0,2 9,8 ± 2,9 1,08 ± 0,07 mTIM-4 3,4 ± 0,2 5,3 ± 0,4 0,4 ± 0,01 mTIM-4 ND 0,7 ± 0,3 8,8 ± 3,5 1,42 ± 0,2 mTIM-4 FW -- -- --

Los valores de los parámetros termodinámicos para la reacción de unión de las proteínas TIM a FS fueron calculados tal y como se explica en Materiales y métodos. Los valores de energía libre de Gibbs (ΔG) obtenidos a 25ºC para la unión de las proteínas mTIM-1, mTIM-3 y mTIM-4 a FS fueron negativos, indicando que la interacción de estas con la FS es un proceso favorable desde el punto de vista energético, y que por lo tanto, ocurre de manera espontánea. Los valores de entalpía (ΔH) calculados son negativos, por lo que la interacción es un proceso exotérmico, que desprende energía. Los valores de entropía (ΔS) obtenidos presentan un valor positivo lo que indica que el proceso genera desorden (Tabla 4.4).

Tabla 4.4. Parámetros termodinámicos para la interacción de las proteínas mTIM-1, mTIM-3 y mTIM-4 con FS obtenidos como se describe en Materiales y métodos. Se muestran los valores de energía libre de Gibbs (ΔG), entalpía (ΔH) y entropía (ΔS). Se muestra media y error de datos correspondientes a dos experimentos.

Proteína) mTIM.1) mTIM.3) mTIM.4)

ΔG)a)25ºC)(Kcal)mol.1)) !8,7%±%1,2% !8,0%±%2,3% !8,7%±%6,1%

ΔH)(Kcal)mol.1)) !0,7%±%0,5% !3,7%±%1,0% !0,5%±%0,1%

TΔS)(Kcal)mol.1)) 7,9%±%0,6% 4,3%±%1,8% 8,2%±%0,1% Figura 4.39. Efecto de la temperatura en la interacción de las proteínas TIM murinas con FS en el BIAcore. A. Sensogramas monitorizados durante la inyección de mTIM-4 (2uM) sobre una superficie con 500 unidades de liposomas de FS a 15ºC (azul), 30ºC (amarillo) y 37ºC (rojo). B. Valores de las constante de asociación (kaso), disociación (kdis) y afinidad (KD) determinadas para las proteínas TIM a diferentes temperaturas.

. A mTIM-4 Tampón' B !"#$%&'()*+',&- %._'/$%&_*%&_0'(

12*',&-&'/*%&0'' ' 34',&-5_'$' ' &.67' !"#$ %"&$ '"!!$ 8.67' !"($$ %")$$ '"!*$$ 9-67' !"%$ *"'$ '"!($ 9:67' +"+$ *"%$ '"*&$ !"#$%9'

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5. DISCUSIÓN: