Qualitative face-to-face interviews

Los resultados incluidos en esta Tesis muestran que las proteínas TIM-1, TIM-3 y TIM-4 son receptores de FS. Así mismo, hemos caracterizado la interacción de las proteínas TIM con FS en detalle, mediante la determinación de estructuras cristalográficas y de diversos análisis bioquímicos y biofísicos.

Las estructuras de las proteínas mTIM-3 y mTIM-4 en complejo con FS mostraron que la molécula de FS se unía al MILIBS característico de las proteínas TIM (26, 128), siendo el modo de reconocimiento muy similar en ambos casos (Fig. 4.21). La cabeza polar del la FS penetra en el bolsillo y determina la especificidad de la interacción. El fosfato de la FS se coordina a un ión calcio que también está coordinado con residuos del lazo FG de las proteínas, mientras que la serina contacta con residuos conservados en todas las proteínas TIM que unen FS. La disposición de la serina unida al fosfato en la L- FS es esencial para su interacción con residuos conservados del MILIBS, lo que explica la estereoselectividad de la unión (128). Adicionalmente, los residuos hidrofóbicos que constituyen las paredes del MILIBS contactan con la región apolar del fosfolípido.

Mediante ensayos de unión de las proteínas TIM a FS en liposomas hemos mostrado que todas las proteínas de la familia TIM son capaces de unirse a FS, excepto mTIM-2 (Fig. 4.14). También mostramos la contribución relevante de los residuos del MILIBS en el reconocimiento de FS, corroborando los datos estructurales. La mutación de los residuos implicados en la coordinación de metal (Asn y Asp) conservados en TIM-1, TIM-3 y TIM-4, demostró que estos residuos son esenciales para la unión específica de estas proteínas a FS en liposomas (Fig. 4.22). Así mismo, la eliminación de las cadenas laterales hidrofóbicas que constituyen las paredes del MILIBS y que contactan con las región apolar de la FS eliminó la interacción, indicando que los residuos hidrofóbicos contribuyen significativamente a la interacción (Fig. 4.22). Los estudios de mutagénesis no sólo han corroborado los datos estructurales, sino que también nos han ayudado a identificar nuevas regiones del dominio IgV de las proteínas TIM implicados en reconocimiento de FS en membranas. Mutaciones en el lazo BC, adyacente al lazo FG y localizado en la parte superior del dominio IgV, mostraron un efecto modulador de la interacción de las proteínas TIM con FS en liposomas (Fig. 4.24), que puede estar

relacionada con la interacción de esta región con la membrana, tal y como se discute más adelante.

La región apolar de la FS, compuesta por las cadenas de ácidos grasos y la molécula de glicerol, ancla el fosfolípido a la membrana celular. Esta zona de la FS interacciona con los residuos hidrofóbicos que forman las paredes de MILIBS. Todas las proteínas TIM que unen FS tienen al menos un residuo aromático implicado en la unión, ya sea en el lazo FG o en el lazo CC´, o en ambos, como es el caso de las proteínas TIM-1 y TIM-4 humanas. Estos residuos contactan con la región apolar de la FS y son esenciales para la interacción. Tal y como han mostrado las estructuras de las proteínas TIM resueltas hasta la fecha, estos residuos aromáticos pueden adoptar diversas conformaciones, que posiblemente determinan la accesibilidad del MILIBS a ligandos. No obstante, la conformación desplegada de estos residuos observada en los complejos cristalográficos de las proteínas TIM con FS, sugieren que podrían penetrar en la membrana celular al interaccionar con FS, posibilidad que ha sido analizada por técnicas biofísicas durante el desarrollo de esta Tesis.

Los estudios de espectroscopía de fluorescencia han mostrado que el espectro de fluorescencia intrínseca de las proteínas TIM-1, TIM-3 y TIM-4 murinas experimenta una variación significativa en presencia de liposomas de FS. La disminución de la intensidad de fluorescencia en presencia de calcio y liposomas de FS indica un cambio del entorno de los residuos de Trp del MILIBS; éstos se encuentran relativamente expuestos al solvente y deben pasar a un entorno más hidrofóbico cuando las proteínas interaccionan con FS en membranas. En presencia de calcio, catión esencial para la unión específica de las proteínas TIM a FS, se observó una disminución del máximo del espectro de fluorescencia, cambio representativo de una inserción poco profunda del Trp en una membrana (30, 139, 171). Este resultado se ajusta a lo observado en los estudios cristalográficos, donde los residuos aromáticos del MILIBS interaccionan preferente con el glicerol de la FS. No obstante, en ausencia de calcio se observó un desplazamiento del máximo de los espectros hacia longitudes de onda menores, bien por la ausencia del apantallamiento de fluorescencia producido por el catión o por la disposición del residuo de Trp en un entorno más hidrofóbico (22, 30). Estos resultados sugieren una cierta tendencia de los residuos aromáticos del MILIBS a interaccionar con membranas, tal y como se ha observado con los péptidos de fusión de virus con envuelta (55), que se encuentran en lazos y contienen residuos aromáticos, similares a los lazos que constituyen el MILIBS. Es posible que en ausencia de calcio los residuos aromáticos del MILIBS penetren más profundamente en la

membrana y contacten con los ácidos grasos de los fosfolípidos. Esta hipótesis también se ajusta a los resultados obtenidos en experimentos de inserción en monocapas, donde mTIM- 4 tiene una mayor capacidad de inserción en membranas de FS en ausencia de calcio (Fig. 4.29). Así pues, el ión de calcio puede determinar el modo de interacción de las proteínas TIM con membranas y su especificidad por FS.

En base a los resultados expuestos en esta Tesis, principalmente los trabajos cristalográficos, hemos elaborado un modelo para la interacción del dominio IgV de las proteínas TIM con FS, presentado en la Figura 5.6. Según este modelo, cuando la cabeza polar de la FS penetra en el MILIBS y se coordina con el ión de calcio, las paredes de la cavidad penetran en la membrana. Los residuos hidrofóbicos contactan preferentemente con el glicerol y la región polar de los ácidos grasos, mientras que los residuos polares del lazo CC´ de TIM-1 y TIM-4 pueden también formar puentes de hidrógeno con las regiones más polares y superficiales de la membrana. En la disposición mostrada para el dominio IgV, el lazo BC adyacente al MILIBS, se sitúa próximo a la membrana, pudiendo interaccionar con ésta y modulando la afinidad de la interacción, tal y como han mostrado los experimentos de mutagénesis de residuos del lazo BC y los ensayos de unión a FS en liposomas.

Figura 5.6. Modelo de interacción de las proteínas TIM con FS en membranas. Representación de la superficie del dominio IgV de la proteína mTIM-3 (verde) y mTIM-4 (azul) unida a una molécula de FS que se encuentra formando parte de una membrana. Se muestran las cadenas laterales de los residuos de la zona superior del lazo CC´ (Trp en mTIM-3 y Asn y Ser en mTIM-4), de los residuos del lazo FG (Leu y Met en mTIM-3 y Trp y Phe en mTIM-4) y del lazo BC (Thr y Ser en mTIM-3 y Arg en mTIM-4).

Membrana( ( BC BC CC´ CC´ FG FG Dominio IgV mTIM-3 Dominio IgV mTIM-4

El modelo de unión de las proteínas TIM a FS presentado es muy similar al descrito para el dominio tipo C2 de la PKCα (79, 156). Esta interacción es dependiente de calcio y estereoespecífica. Así mismo la PKC contiene residuos hidrofóbicos en los lazos que rodean la zona de interacción con la FS, que pueden establecer interacciones adicionales con la membrana celular. Además, tal y como describimos para el lazo BC en los TIM, se ha descrito que una región adyacente a aquella que interacciona con la FS, puede modular la afinidad de esta proteína por FS en membranas.

El uso del BIAcore nos ha permitido cuantificar la interacción de las proteínas TIM con FS en membranas. Estos experimentos presentaron una gran reproducibilidad, independiente del tipo de superficie y muestra proteica analizada. Así mismo, la dependencia de calcio de la interacción, nos ha permitido regenerar la superficie con EDTA y preservar la actividad de la misma durante un gran número de ciclos consecutivos de unión y regeneración. La interacción inespecífica de las proteínas con el chip L1, relativamente menor, ha sido corregida con una superficie control que contenía liposomas de FC. Por lo tanto, el uso de liposomas y un chip L1 nos ha permitido determinar la afinidad y las constantes cinéticas de interacción de proteínas TIM monoméricas con FS en liposomas. Así mismo, hemos realizado experimentos a varias temperaturas para la determinación de parámetros termodinámicos.

Las constantes de asociación calculadas para mTIM-1 y mTIM-4 (~3x105 M-1s-1), son similares e indicativas de una reacción de asociación rápida. No obstante, mTIM-3 presenta una constante de asociación unas 3 veces menor (~1x105 M-1s-1), principal responsable de la menor afinidad de esta proteína por FS (Tabla 4.3. y Fig. 4.14). Las constantes de disociación para las tres proteínas son altas y similares (orden 10-1 s-1), ligeramente mayor para mTIM-3 (Tabla 4.3), e indicativas de una interacción monomérica débil, similar a las descritas para interacciones intercelulares para moléculas de adhesión celular (154). Las moléculas de adhesión celular presentan una constante de afinidad moderada debida a una disociación muy rápida, lo que permite a estas moléculas mediar interacciones reversibles rápidas como las que realizan los linfocitos para el reconocimiento de otros tipos celulares. La afinidad calculada para la interacción de las proteínas TIM con FS (~300-1000 nM) es menor a la calculada para otras proteínas como la anexina V (5 nM), el factor de coagulación VIII (0,5 nM) o MFG-E8 (2 nM) (44, 121, 133). Así mismo, la afinidad calculada mediante ensayos de unión a FS en liposomas para la proteína dimérica TIM4-Fc fue de 2 nM (96). Sin embargo, esta afinidad no es comparable con los datos obtenidos mediante la técnica de BIAcore para las proteínas

TIM monoméricas. Por ello, sería interesante determinar la afinidad de las proteínas TIM diméricas en BIAcore.

Los valores termodinámicos de la interacción de las proteínas TIM con FS mostraron que la constante cinética de asociación disminuye con la temperatura y que por lo tanto la reacción es exotérmica (ΔH negativo), como la mayoría de las interacciones proteína:proteína estudiadas hasta la fecha. Esto indica que la interacción no requiere cambios conformacionales significativos en la proteína para la interacción con FS y que la interacción libera energía, posiblemente debida al cambio de entorno de los residuos hidrofóbicos del MILIBS, que puede ser invertida en cambios en la membrana. La entropía de la interacción de las proteínas TIM con FS en membranas es positiva, y puede ser indicativa de un aumento de desorden provocado por la interacción con la membrana.