RESEARCH METHODOLOGY

La estructura de la forma cristalográfica X1 de mTIM-4 mostró que el dominio N- terminal rico en cisternas adoptaba un plegamiento tipo inmunoglobulina (Ig) del tipo variable (IgV), muy similar al que se había descrito para mTIM-1 (129). El dominio IgV de mTIM-4 presenta dos láminas β, la lámina β BED y la GFC, que formaban una estructura de sándwich β. Las hebras de la lámina β BED son particularmente cortas y están unidas por largos lazos, mientras que en la cara opuesta, las hebras A, G, F, C y C´ que forman la lámina β GFC son más largas (Fig. 4.7A). Un residuo conservado de Pro anterior al primer residuos de cisteína del dominio, podría ser el representante de la menor longitud de la hebra β B. El primer y último residuo de cisteína de este dominio forma un puente disulfuro interno que une el sándwich β como ocurre en la mayoría de los dominios tipo Ig (7), mientras que los otros cuatro residuos de cisteína característicos de la familia TIM forman dos puentes disulfuro externos que unen la parte inferior del largo lazo CC' a la lámina β GFC. La zona inferior del largo lazo CC' se encuentra unido a la lámina β GFC mediante dos puentes disulfuro formados por las cuatro cisteínas extra que presentan

las proteínas TIM en su dominio IgV (Fig. 4.7). El vértice del lazo CC´ se encuentra conectado a la lámina β mediante puentes de hidrógeno con las cadenas laterales de los residuos básicos Arg88 y Lys99, situados en las hebras β F y G, respectivamente (Fig. 4.7A). La conformación del lazo CC´ en mTIM-4 es muy similar a la similar a la de mTIM-1 (Fig.4.7B), proteína que también contiene los dos residuos básico en las hebras β F y G.

La secuencia del lazo FG de mTIM-4 es muy similar al de mTIM-1, ambos presentan en la zona superior del lazo FG dos residuos aromáticos (Trp y Phe). En la estructura de mTIM-1, el residuo de Phe del lazo FG se haya dispuesto hacia en lazo CC´, de manera que ambos lazos aparecen conectados (Fig. 4.7B). Sin embargo, en la estructura de mTIM-4 los lazos CC´ y FG aparecen desconectados debido a un cambio conformacional de la cadena lateral del residuo de Phe, de manera que se crea una pequeña cavidad formada por los lazos CC´ y FG (Fig. 4.7B). Esta cavidad está formada en la parte inferior por el vértice del lazo CC´ y los residuos básicos a los que está conectado, y en la parte superior, por los residuos aromáticos de Trp y Phe del lazo FG.

Figura 4.7: Estructura cristalográfica del dominio N terminal de mTIM-4. A. Diagrama tipo ribbon de la estructura del dominio IgV de mTIM-4 (Forma cristalina X1). Las láminas β y los lazos de la parte superior del dominio están indicados en mayúsculas, mientras que los extremos N y C terminales están señalados en minúsculas. Los residuos de cisteína y los puentes disulfuro se muestran en verde. Los residuos situados entre los dos puentes disulfuro en el lazo CC’ se representan con barras y bolas en amarillo. Los residuos Arg88 (R) y Lys99 (K) que anclan el lazo CC’ a las hebras β F y G, respectivamente, se muestran en naranja. Los puentes de hidrógeno se representan en cilindros discontinuos rosas. B. Vista de las estructuras sobrepuestas de los dominios IgV de mTIM-1 (rojo) y mTIM-4 (azul) cristalizadas en condiciones muy similares. Se incluyen las cadenas laterales de Phe con distinta conformación en el lazo FG. C. Vista de las estructuras sobrepuestas de los dominios IgV de mTIM-4/X1 (azul) y mTIM-4/X2 (magenta). Se muestran las cadenas laterales del residuo Phe96 de ambas estructuras.

FG# CC´# BC# BC# FG# CC´# R# K# A _FG# CC´# BC# F# mTIM%1' mTIM%4/X1' B C mTIM%4/X1' mTIM%4/X2' F#

La estructura de la segunda forma cristalográfica de mTIM-4 (mTIM-4 X2), cristalizada en una condición de cristalización con una concentración elevada de tartrato, era prácticamente idéntica a la de la forma cristalográfica X1 (Fig. 4.7C). El anillo aromático del residuo de Phe en el lazo FG también se encuentra alejado del lazo CC´, de manera que ambos lazos están desconectados, como ocurría en la forma cristalográfica X1.

Gracias a la alta resolución conseguida con estos cristales, pudimos observar la presencia de una molécula de tartrato en el interior de la cavidad formada por los lazos CC’ y FG (Fig. 4.8A). El tartrato formaba enlaces de hidrogeno con varios residuos de la proteína (Fig. 4.8B). El grupo carboxilato del tartrato también estaba coordinado a un ión Figura 4.8: Sitio de coordinación de metal del lazo FG del dominio IgV de mTIM-4. A. Representación de la superficie de la zona superior del dominio IgV de la forma cristalina X2. El tartrato se muestra con los carbonos en amarillo y los oxígenos en rojo. El átomo de sodio al que esta coordinado el tartrato se muestra en verde. En la proteína los oxígenos están representados en rojo, los nitrógenos en azul y los carbonos en gris. Se marcan los lazos. B. Vista detallada del sitio de coordinación del ión metálico. El ión (esfera verde) se encuentra coordinado con el tartrato, con oxígenos de la cadena principal y lateral de residuos del lazo FG, y con una molécula de agua (esfera roja). Se muestra el mapa de densidad Fo-Fc para el tartrato y el ión metálico. Los enlaces de hidrogeno se representan como líneas discontinuas en naranja y las coordinaciones en rojo. C. Alineamiento de los dominios IgV de las proteínas TIM murinas. Las láminas ß están marcadas con líneas, los residuos conservados están en amarillo y las cisteínas en verde. Los sitios potenciales de N-glicosilacion están subrayados. Los sitios de coordinación con el catión en mTIM-4 están en rojo, y los residuos aromáticos del lazo FG que forman la cavidad están coloreados en magenta. Las proteínas TIM humanas y de mono están alineadas por secuencia.

FG#

FG#

CC´#

#

_CC´#

A

C

metálico, que a su vez mantenía una coordinación octaédrica con una molécula de agua y con varios residuos conservados de la proteína (Fig. 489B). Los residuos proteicos que coordinan con el metal (Asn y Asp), así como la conformación del lazo CC´ que modela la cavidad, están conservados en todas las proteínas de la familia TIM, excepto en mTIM-2 (Fig. 4.8C), lo que sugiere que este sitio de unión a ligando dependiente de ión metálico (metal ion-dependent ligand binding site, MILIBS) identificado en la estructura de mTIM- 4, debe de estar conservado en las proteínas TIM.

4.2.3. Cristalización y determinación de la estructura del dominio N-

terminal de mTIM-3.

Para la cristalización de mTIM-3 se probaron condiciones de cristalización cercanas a aquellas usadas para otras proteínas TIM (129). Los cristales de mTIM-3, se obtuvieron mediante el método de gota sentada en una condición de cristalización con un elevado contenido de PEG-2000 metil-éter, similar a la anteriormente usada para mTIM-1 y la forma cristalográfica X1 de mTIM-4. Previo a su congelación, los cristales de mTIM-3 se transfirieron a una solución de cristalización que contenía 5% glicerol como crioprotectante, se montaron en criolazos y se transportaron congelados en nitrógeno líquido a las líneas de sincrotrón del ESRF para la colección de datos cristalográficos. Estos cristales, que forman agrupaciones de barras, pertenecen al grupo espacial P21,

presentan una molécula en la unidad asimétrica y un 43% de solvente (Fig. 4.9).

La determinación de la estructura cristalográfica de mTIM-3 se llevó a cabo mediante el método de reemplazo molecular usando el programa PHASER (89, 101) y un modelo derivado de una estructura del mismo dominio de mTIM-3 resuelta con anterioridad (PDB ID 2OYP)(10). Durante el proceso de refinamiento, el modelo se ajustó

Figura 4.9. Cristales del dominio N-terminal de mTIM- 3. Cristales con forma de barras crecidos en agrupaciones del dominio N-terminal de mTIM-3.

a los mapas de densidad electrónica manualmente y con el programa Phenix.refine (147). Las estadísticas del modelo final se presentan en la Tabla 4.1.