Para verificar las suposiciones establecidas respecto a la inducción de las exo y endopectinasas por el ácido galacturónico liberado de la estructura principal de la pectina, así como lo referente a la posible represión catabólica causada por la presencia de azúcares reductores en el medio, se desarrollaron los experimentos de transferencia. En estos experimentos, se transfirió micelio precrecido en glucosa a diversos matraces con medio mineral fresco en el que la pectina era la única fuente de carbono. Cuando comenzó la producción de las pectinasas (12 h después de la transferencia), se agregó ácido galacturónico o glucosa en algunos de los matraces, y se verificó el comportamiento del cultivo con cada azúcar adicionado, comparando contra un experimento control (sin adición). La metodología empleada para esta serie experimental se describe detalladamente en la sección 4.4.2 (de Materiales y Métodos).
El crecimiento obtenido en las tres condiciones experimentales fue semejante durante las primeras 8 h de cultivo después de la adición, sin embargo pareció verse favorecido por la adición de azúcares reductores al medio (Figura 6A). Así, la concentración de biomasa fue mayor en los experimentos a los que se les adicionó ácido galacturónico o glucosa (Figura 6A). El incremento en la biomasa provocado por la adición de azúcares reductores es un hecho que se ha reportado previamente para otras cepas, como A. oryzae durante la producción de α-amilasas (Carlsen y Nielsen, 2001) y A. niger en la producción de pectinasas (Panda et al, 2004).
Durante las primeras horas después de la adición de los sustratos, el ácido galacturónico provocó una mayor producción de exopectinasas, en comparación con la cantidad producida en el experimento control. Esta diferencia fue más notable hacia el final del cultivo, donde hubo una variación de aproximadamente 15 U mL-1 con respecto a la actividad exopetinolítica observada en el control. El obvio incremento en la producción de las exopectinasas debido a la adición de
Regulación por la fuente de carbono de la producción de pectinasas en Aspergillus flavipes FP-500
Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500
59 ácido galacturónico, apoya el papel de inductor de esta fuente de carbono sobre la actividad exopectinolítica.
En lo que respecta a la glucosa, ésta ocasionó una disminución evidente en la producción de exopectinasas en las primeras 4 h después de la adición, que reafirma la idea del efecto represor de este azúcar sobre dicha actividad. Sin embargo, después de ese decremento se observó un nuevo aumento en la producción, y hacia el final de cultivo la actividad de exopectinasas fue igual a la observada en el experimento control. Lo anterior sugiere que, si bien la actividad exopectinolítica sufre represión catabólica, este efecto es transitorio en la medida en que la glucosa desaparece del medio. Un comportamiento semejante se reportó para las poligalacturonasas de A. terreus, mediante experimentos de transferencia similares a estos (Runco et al, 2001).
En lo que se refiere a la producción de endopectinasas, esta se vio afectada drásticamente con la adición tanto de glucosa como del ácido galacturónico (Figura 6 C). Así, mientras que la producción de estas enzimas durante las primeras 10 h después de la adición fue semejante a la del experimento control, durante las siguientes 12 h esta se mantuvo prácticamente constante en los cultivos a los que se adicionaron los azúcares reductores. A pesar de que la producción de esta actividad enzimática se recuperó alrededor de las 40 h del cultivo, en ningún caso se alcanzaron los niveles del control (Figura 6C). Este comportamiento pudo deberse a que, con la adición de la glucosa o el ácido galacturónico, la concentración de azúcares reductores presentes en el medio se incrementó, y fue sólo hasta que esta disminuyó, alrededor de las 40 h (datos no mostrados), que se pudo observar un incremento en la producción de las endopectinasas.
Finalmente, en lo que se refiere a la producción de pectin liasas, al parecer las condiciones iniciales de operación utilizadas en estos cultivos provocaron un retraso en dicha actividad enzimática, ya que esta comenzó a detectarse hasta las 20 h después de la transferencia de
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60 micelio. En los cultivos en los que sucedió la adición de glucosa o ácido galacturónico, la producción de pectin liasas se retrasó 20 h más, comenzando a observarse hasta las 38 h de cultivo, en una proporción pequeña con respecto a la del experimento control (Figura 6D).
Para probar algunas de las hipótesis generadas, referidas al posible efecto represor que ejerce la glucosa sobre las pectinasas, así como la probable reversibilidad de dicho efecto represor, se propuso el diseño de un cultivo alimentado. El objetivo principal de este era mantener una condición fisiológica aproximadamente estable en el cultivo, y cambiar las fuentes de carbono disponibles en el medio, para verificar las respuestas del hongo ante tales condiciones de operación. A 0 1 2 3 4 5 6 C rec im ient o ( m g m L -1) B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 E x o pec ti na s a s ( U mL -1 ) C 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 10 20 30 40 50 60 Tiempo (h) E ndo pec ti n a s a s ( U m L -1 ) D 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 10 20 30 40 50 60 Tiempo (h) Pe c ti n l ia s a s ( U m L -1 )
Figura 6. Experimento de transferencia de micelio, desarrollado a nivel matraz con pectina al 1% (p/v) como fuente de carbono. Crecimiento (A), producción de exopectinasas (B), endopectinasas (C) y pectin liasas (D), del experimento control (sin adición ¡), con adición (indicada por la flecha) de ácido galacturónico () o glucosa (S) al cabo de las 12 h después de la transferencia.
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