4.4.1 Cultivos en matraz.
Para evaluar el efecto de la fuente de carbono y el pH inicial del medio sobre el crecimiento del hongo y la producción de pectinasas, A. flavipes FP-500 se hizo crecer en medio basal, utilizando
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 24 diversas fuentes de carbono: pectina cítrica, ácido poligalacturónico, ácido galacturónico, arabinosa, ramnosa, xilosa, lactosa, glicerol y glucosa. Cuando se utilizaron monosacáridos como fuente de carbono, el medio de cultivo fue adicionado con extracto de levadura al 0.1% (p/v). Para cada una de las fuentes de carbono utilizadas se probaron tres valores iniciales de pH (3.5, 4.2 y 5.0), que se lograron mediante la adición de los volúmenes adecuados de soluciones de NaOH o H2SO4 2M al medio de cultivo. En estos experimentos solo se registró el cambio del pH
a lo largo del cultivo. Todos los matraces se incubaron a 37ºC, en un agitador reciprocante a 200 rpm. Se tomaron muestras periódicas a cada matraz cada 24 h, a las que después de registrarles el pH, se filtraron conservando el filtrado en congelación hasta su análisis.
4.4.2 Experimentos de transferencia
Para evaluar de manera preliminar el efecto inducible o represor del ácido galacturónico o glucosa, respectivamente, sobre la producción de pectinasas, se desarrolló el experimento de transferencia de micelio. Para esto, se inocularon los matraces con la cantidad adecuada de esporas de A. flavipes FP-500 y se incubaron en el medio basal adicionado con glucosa al 1% como única fuente de carbono y extracto de levadura al 0.1%, como potenciador para la germinación de las esporas. Al cabo de 16-18 horas, cuando el cultivo se encontraba en la fase de crecimiento exponencial, se colectó por filtración el micelio obtenido, lavándolo en tres ocasiones con solución salina (NaCl al 0.9%) estéril a 4°C. El último lavado se realizó con medio basal estéril, y se obtuvo una suspensión de micelio, cuya concentración se determinó mediante la técnica de peso seco. Con el volumen adecuado de dicha suspensión se inocularon 0.5 g L-1 de micelio a matraces que contenían medio basal y pectina al 1% como fuente de carbono. Al cabo de 12 h, se adicionó a los matraces la cantidad adecuada de soluciones concentradas estériles de glucosa o ácido galacturónico para alcanzar una concentración final de 1 g L-1. Se utilizó un control sin adición, para comparar los resultados. Después de la adición, se tomaron muestras
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 25 cada 4 h, hasta completar 24 h de cultivo. Las muestras se filtraron, y se cuantificó el crecimiento por peso seco. El sobrenadante se mantuvo en refrigeración hasta su análisis. Todos los experimentos se llevaron a cabo a un pH inicial de 4.2, el cual evolucionó libremente a lo largo del cultivo, registrando su valor en el momento de tomar las muestras. Los matraces se incubaron a 37ºC, en un agitador reciprocante a 200 rpm.
4.4.3 Cultivo por lote en fermentador.
Para observar la evolución de los parámetros de operación a lo largo del cultivo y conocer la relación de este con la producción de las pectinasas, se utilizó un biorreactor BioFlo 110, Newbrunswick Scientific, de 7 L, con 5 L de volumen de operación. Al fermentador se le instalaron los bafles y dos impulsores, la distancia en la cual se colocaron los impulsores se determinó con base en el diámetro del reactor. Así el primer impulsor se colocó a una distancia igual a 1 diámetro y el segundo a 1.5 diámetros a partir de la base del reactor. Los cultivos en lote desarrollados a nivel matraz utilizaron el medio basal descrito previamente. Y como única fuente de carbono se empleó pectina, glucosa o ácido galacturónico, inoculando en cada caso con 1 X 106 esporas mL-1. En general, se emplearon para estos cultivos tres valores de pH inicial: 3.5, 4.2 y 5.0, empleando para ello una de dos modalidades. En la primera de ellas, el pH de los cultivos se dejó evolucionar libremente, registrando de manera continua los cambios en este parámetro a lo largo del experimento. Para la segunda, se mantuvo constante el valor del pH inicial, mediante la adición de NaOH, controlada por el reactor.
Para ambas modalidades, los cultivos operaron a 400 rpm, 37°C y 0.5 vvm de aire, registrando la evolución del oxígeno disuelto (dO2) durante todo el cultivo. Se tomaron muestras periódicas
cada 4 h, a las cuales se les determinó la concentración de biomasa, el consumo de sustrato, la concentración de grupos reductores y las actividades pectinolíticas, mediante las técnicas descritas más adelante.
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 26 4.4.4 Cultivo alimentado en fermentador
Para establecer el cultivo alimentado, fue necesario conocer los parámetros cinéticos del microorganismo al desarrollarse en un cultivo en lote sobre la fuente de carbono deseada (glucosa o pectina), en un valor de pH constante. Así, los parámetros cinéticos utilizados se obtuvieron de un cultivo en lote desarrollado previamente. De esta manera, fue posible el establecimiento de las condiciones de estado estacionario cuando el cultivo en lote llegó a condiciones de baja concentración de sustrato (<1 g L-1). Para conocer el tiempo aproximado en que esto sucedía, se modelaron los datos experimentales obtenidos en cultivos desarrollados en lote (Aranda-Barradas et al, 2000), misma que se describe detalladamente más adelante dentro de este apartado.
Mediante este modelamiento, además de conocer el tiempo en que debía iniciar la alimentación, se obtuvieron los valores de los parámetros cinéticos del microorganismo. Con estos datos fue posible calcular la concentración del sustrato en la corriente de alimentación, mediante la siguiente fórmula: XS Y X S0 = Donde 0
S es la concentración de sustrato en la corriente de alimentación.
X es la concentración de biomasa en el tiempo en que se alcanzan las condiciones adecuadas para comenzar a alimentar.
XS
Y es el rendimiento biomasa-sustrato, parámetro calculado a partir de la modelación de los resultados obtenidos del cultivo en lote.
Para el establecimiento del cultivo alimentado, se partió de un cultivo en lote desarrollado en un volumen de 2L de medio en el reactor, con un pH constante de 3.5. Cuando en este cultivo se alcanzaron las condiciones adecuadas respecto a la concentración del sustrato, comenzó el
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 27 proceso de alimentación. Para ello, se utilizó un flujo de 0.042 L h-1, con el objetivo de incrementar 1 L día-1 el volumen del reactor. El régimen de alimentación se dividió en tres etapas de 24 h, durante las cuales se investigó si las condiciones específicas empleadas en cada caso provocaban un cambio en la producción de pectinasas. No obstante el régimen de alimentación empleado, durante la primera etapa se utilizaron las mismas condiciones empleadas en el desarrollo del cultivo lote que sirvió como punto de partida.
Durante el desarrollo de los cultivos en lote se utilizó un medio basal formulado con la concentración de sales adecuada para un volumen final de 5 L. Así, en todo momento las sales que componían al medio basal estuvieron en exceso. Por otra parte, la aireación se suplementó a 2.5 L min-1 a lo largo de todo el régimen de alimentación. Para descartar el efecto de la evolución del pH sobre la producción de las pectinasas, el valor de este parámetro se mantuvo constante durante todo el experimento, mediante la adición de NaOH o H2SO4 2 M. Los cultivos se
mantuvieron a 37°C y una agitación de 400 rpm, tomando muestras periódicas cada 4 h. Las muestras se filtraron, para cuantificar la concentración de biomasa, mientras que el filtrado se mantuvo en congelación hasta su análisis, en el cual se cuantificó la concentración de sustratos, azúcares reductores y las actividades pectinolíticas.
Los regímenes de alimentación utilizados en esta etapa experimental fueron de dos tipos. En el primero, se revisó el efecto de diferentes fuentes de carbono, mientras que con el segundo se analizó el resultado de la variación del pH sobre la producción de las pectinasas por A. flavipes FP-500.
Los valores de µ y D para los datos experimentales, se calcularon mediante el empleo de las siguientes expresiones: X V S Y F XS 0 = µ y 0 S Y X D XS µ =
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 28 Donde
µ es la velocidad específica de crecimiento de los datos del experimento F es el flujo de alimentación. En todos los casos, F = 0.042 L h-1
.
YXS es el rendimiento, calculado a partir del experimento en lote utilizado como base.
S0 es la concentración de la fuente de carbono en el flujo de alimentación
V es el volumen del reactor. Para el cálculo de este, se consideró la velocidad de alimentación
X es la concentración de biomasa obtenida en el reactor en cada tiempo D es el factor de dilución de los datos del experimento