Para determinar, de manera general, cómo sucede la producción de las pectinasas de A. flavipes FP-500 a lo largo del cultivo desarrollado en pectina, se llevaron a cabo cultivos en lote a nivel biorreactor, empleando un reactor automatizado (BioFlo 110, Newbrunswick Scientific). Mediante estos experimentos fue posible monitorear los parámetros de operación a lo largo del desarrollo del cultivo, así como un muestreo frecuente del mismo. La metodología empleada para el desarrollo de estos cultivos se describe ampliamente en la sección de Materiales y Métodos. Ante la presencia de un polisacárido, el hongo tiene que producir las enzimas que necesita para obtener de éste sus azúcares constitutivos y poder metabolizarlo. Considerando que los hongos filamentosos del género Aspergillus producen diferente cantidad y tipo de enzimas, en dependencia con la fuente de carbono sobre la que se les haga crecer (Teixeira et al, 2000;
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53 Carlsen y Nielsen, 2001; Lenartovicz et al, 2003), en el estudio del cultivo de un hongo con un polisacárido como única fuente de carbono, la concentración de azúcares reductores liberados es un factor que podría apoyar en el entendimiento de la acción de las actividades enzimáticas producidas.
Al analizar los resultados obtenidos mediante el desarrollo del cultivo, se observó que al inicio del mismo la concentración de azúcares reductores fue baja, pero se incrementó hasta 2 g L-1 al cabo de las primeras 24 h (indicado por la línea punteada en la Figura 5). Posteriormente, se observó una disminución en la concentración de grupos reductores, hasta obtener valores menores de los 0.5 g L-1, comportamiento que se mantuvo aproximadamente estable desde las 40 h hasta el final del cultivo (Figura 5A). En lo que respecta a la pectina existente en el medio, su concentración comenzó a disminuir conforme se observó la aparición de azúcares reductores, lo que indicó que este sustrato polimérico se estaba degradando a sus azúcares constitutivos (Leathers, 2004; Talebnia et al, 2008). La disminución en la concentración de pectina fue evidente entre las 16 y las 40 h, donde de hecho se desarrolló la fase de crecimiento exponencial (Figura 5A). Al cabo de ese tiempo, la concentración de pectina remanente en el medio se mantuvo aproximadamente constante hasta el final del cultivo, al mismo tiempo que sucedió la fase de mantenimiento de la biomasa (Figura 5A).
El análisis de la evolución en la concentración de grupos reductores a lo largo del cultivo podría explicarse tomando como base el progreso en la producción de las diversas actividades pectinolíticas. Para facilitar la comparación de los resultados y verificar las posibles correlaciones existentes entre la producción de las pectinasas y la evolución de los azúcares reductores, se calculó la producción específica de las enzimas, es decir, la relación resultante entre la actividad enzimática producida y la concentración de biomasa observada en ese tiempo.
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54 En lo que respecta a la producción de exopectinasas, es posible observar un pico de producción específica máxima durante las primeras 24 h de cultivo (Figura 5B). Lo anterior sugiere la producción de las isoformas constitutivas de las exopectinasas producidas por A. flavipes FP-500 durante las primeras horas de cultivo. La congruencia en el incremento de la actividad exopecinolítica con el de la concentración de grupos reductores sugiere que estos últimos se liberan al medio por la acción de las exopectinasas constitutivas, producidas en los tiempos iniciales dentro del cultivo. Cuando la concentración de azúcares reductores disminuyó, también se observó una ligera reducción en la actividad exopectinolítica, aunque esta volvió a incrementarse al cabo de las 40 h, hasta alcanzar su máximo hacia el final del cultivo. El segundo incremento en la actividad de exopectinasas puede corresponder a las isoformas inducibles de las mismas, producida debido a la liberación de los grupos reductores en las primeras 24 h de cultivo. Aunque no fue posible caracterizar la cantidad y tipo de grupos reductores liberados en cada tiempo de muestreo, es probable que el pico de concentración máxima de azúcares reductores estuviera conformado en su mayoría por ácido galacturónico, clasificado anteriormente como un inductor de esta actividad enzimática. Esto, desde luego, deberá verificarse experimentalmente.
Por otra parte, la actividad de endopectinasas comenzó a observarse hasta después de las primeras 24 h de cultivo, cuando la concentración de azúcares reductores comenzaba a disminuir. Luego de ese tiempo, la producción de la actividad endopectinolítica se incrementó, alcanzando su máximo hacia el final del cultivo. Los resultados obtenidos para las actividades exo y endopectinolíticas sugieren que existe cierta relación entre el producto de la acción de la actividad exopectinolítica y la producción de las endopectinasas en este cultivo. Al parecer, los azúcares reductores producidos por la acción de las isoformas constitutivas de las exopectinasas, fueron también los inductores de la actividad endopectinolítica observada.
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A
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P e c ti na ( g L -1 ) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 A z úc a res r e d u c tores ( g L -1 )B
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 E x opec ti nas a s (U g de b iom as a -1 ) E ndope c ti nas as ( U g de bi om as a -1 )C
0 1 2 3 4 5 6 7 0 20 40 60 80 Tiempo (h) P e c ti n l ias as ( U g de bi om as a -1 )Figura 5. Evolución del cultivo en lote desarrollado a nivel biorreactor, utilizando pectina como fuente de
carbono. Se partió de un pH inicial de 3.5, mismo que se dejó evolucionar libremente a lo largo del cultivo. A. Consumo de pectina (¡), liberación de azúcares reductores () y Biomasa (∗); B. Producción específica de exopectinasas () y endopectinasas (S); y C. Producción específica de pectin liasas (z) y pH (X).
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56 La relación de la producción de exo y endopectinasas permite sugerir un modelo de acción de estas enzimas. En principio, las exopectinasas producidas de manera constitutiva actúan sobre los pocos extremos no reductores de la estructura de la pectina, liberándolos al medio. Con esto, se incrementa ligeramente la concentración de azúcares reductores, mismos que ingresan a la célula y se encargan de inducir al sistema pectinolítico, lo que provoca la secreción masiva de las pectinasas por parte del microorganismo. Una vez en el medio, las pectinasas inducidas recientemente actúan sobre la estructura de la pectina. Las endopectinasas provocan rupturas a lo largo de la cadena principal, y generan con ello más extremos no reductores, que quedan disponibles para el ataque masivo por parte de las exopectinasas recientemente inducidas. Un modelo semejante permitió explicar la acción concertada de las celulasas (Prade, 1995), lo que fortalece el modelo sugerido de acción sinérgica de las pectinasas en A. flavipes FP-500.
La producción específica de pectin liasas observada durante las primeras 24 horas del cultivo parece confirmar la propuesta referente a la producción de isoformas constitutivas de esta actividad enzimática en A. flavipes FP-500. Dentro del modelo anteriormente propuesto, la producción de las pectin liasas pareciera ser independiente de la acción de las endopectinasas, y estar relacionada con la liberación de los inductores debido a la acción de las exopectinasas sobre la pectina. Sin embargo, hay reportes que indican que esta actividad enzimática se regula principalmente por el pH del medio (Yakobi et al, 2000). Como se puede observar, la disminución en la actividad específica de pectin liasas fue concordante con la disminución del pH, mientras que el aumento de esta actividad coincidió con el incremento en el pH (Figura 5C). En la sección 5.3 se discutirán con detalle experimentos planteados para revisar el efecto del pH sobre la producción de pectin liasas.
La disminución en la producción de las exopectinasas observada a las 40 h de cultivo, así como la ligera disminución en la tendencia de la producción de endopectinasas en ese mismo tiempo
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57 (Figura 5B), podrían deberse al efecto de la concentración de azúcares reductores presentes en el medio a las 24 h (Figura 5A). Lo anterior sugeriría la posibilidad de que algunas de las isoformas inducibles de las exopectinasas y las endopectinasas estén sujetas a represión catabólica, como en general sucede para muchas pectinasas (de Vries, 2003; Flipphi et al, 2003). Además, a partir del análisis de estos resultados podría decirse que esa represión sucede cuando la concentración de azúcares reductores en el medio es mayor a 2 g L-1. Un comportamiento parecido se reportó para las poligalacturonasas de A. niger, cuya producción disminuyó considerablemente cuando en el medio había concentraciones de glucosa de 7 g L-1 (Panda et al, 2004), mientras que la expresión
de las endopectinasas de A. citri se vio fuertemente reprimida con concentraciones de glucosa del 1% (p/v) en el medio de cultivo, o ante la presencia de elevadas concentraciones de fructosa y sacarosa, como sucede en el jugo de frutos cítricos (Akimitsu et al, 2004).
A pesar de que para la producción de pectin liasas sucedió también una disminución al cabo de las 24 h de cultivo, no es posible sugerir que en este caso el efecto de una represión catabólica, si se consideran los resultados obtenidos en el cultivo en lote desarrollado sobre pectina con un pH inicial de 5.0 (no mostrados). En ese caso se observó, durante las primeras horas, una producción de pectin liasas mayor que la reportada para este experimento, aún cuando la concentración máxima de azúcares reductores fue mayor de 2 g L-1 (datos no mostrados). En la naturaleza, se ha encontrado que las pectin liasas actúan sobre todo en la cáscara de los frutos cítricos para macerar los tejidos, durante la invasión de estos por microorganismos patógenos (Deising et al, 1995; Maccheroni et al, 2004). Debido a que en dichos materiales difícilmente se encuentran azúcares reductores libres, no sería extraño que estos grupos no ejercieran un efecto importante en la regulación de la producción de pectin liasas por A. flavipes FP-500.
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