Para verificar el posible efecto del pH sobre la producción de las pectinasas de A. flavipes FP- 500, se consideraron, en primera instancia, los cultivos en lote desarrollados a nivel matraz, en los que se utilizaron diferentes valores de pH inicial. Para determinar dichos valores, se tomó en cuenta el pH de muchos de los tejidos que pueden servir como huéspedes para este hongo, y que se extienden desde un nivel ácido (pH 3.32) hasta alguno cercano a la neutralidad (pH 6.30) (Manteau et al, 2003). Uno de los objetivos de esta etapa experimental era observar el comportamiento del microorganismo, respecto a la producción de las pectinasas, ante diversos valores de pH, y obtener una correlación de dicha producción con las condiciones de pH inicial probadas.
Los resultados obtenidos a partir de los cultivos desarrollados sobre diferentes fuentes de carbono, para los que se utilizaron 3 valores diferentes de pH inicial, mostraron que la mayor producción de exopectinasas y endopectinasas se obtuvo, en su mayoría, en los medios con los valores más ácidos (Tablas 2 y 3), mientras que la generación de pectin liasas no presentó un patrón específico respecto al pH inicial del medio. Para esta actividad pectinolítica, las mayores producciones se obtuvieron en diferentes valores de pH inicial, dependiendo de la fuente de carbono utilizada (Tabla 4). El comportamiento observado respecto a la producción de pectinasas de A. flavipes FP-500 en los distintos valores de pH inicial, sugiere que existe un efecto de este parámetro sobre dicha producción.
Para estudiar el efecto del pH sobre la producción de pectinasas, se llevaron a cabo cultivos en lote a nivel biorreactor, utilizando diferentes condiciones de pH. Para establecer estos cultivos, se tomaron como base los resultados obtenidos en los cultivos en lote desarrollados a nivel matraz, mismos que se describieron en la sección 5.1, y considerando que los mejores inductores de la producción de pectinasas por A. flavipes FP-500 fueron la pectina y el ácido galacturónico, estos
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 73 cultivos se desarrollaron con estas fuentes de carbono a dos condiciones de pH inicial: 3.5 y 5.0. En estos cultivos, se permitió la libre evolución del pH, y se registró el valor de este parámetro a lo largo de los mismos. Cuando se utilizó como fuente de carbono pectina, para ambos valores de pH inicial del medio (3.5 y 5.0), el microorganismo creció con diferentes velocidades específicas (µ = 0.1367 ± 0.01 y 0.1703 ± 0.008 h-1
, respectivamente). Debido a lo anterior, para eliminar cualquier efecto que las diferencias observadas en los valores de µ pudieran provocar en la interpretación de los resultados, los resultados presentados en esta sección se reportan como las actividades específicas obtenidas en cada punto muestral.
Durante las primeras horas de cultivo, el pH en el medio permaneció relativamente constante, luego disminuyó hasta alcanzar su valor más bajo y finalmente se incrementó hacia las últimas horas del cultivo (Figura 11 A). En lo que respecta a la producción de exopectinasas, en cualquiera de los valores de pH inicial utilizados se presentaron dos etapas donde se obtuvo un máximo de actividad específica. La primera de ellas se observó entre las 0 y las 36 h de cultivo, en donde el máximo de la actividad específica se alcanzó a las ∼ 20 h en los medios con pH inicial de 3.5, y a las ∼ 10 h cuando el cultivo inició en un pH de 5.0 (Figura 11 B). Al cabo de las 36 h, después de la disminución que marcó el fin de la primera etapa, la producción específica de las exopectinasas se volvió a incrementar, hasta alcanzar un nuevo máximo al final del cultivo. La delimitación de ambas etapas de producción de exopectinasas se correlaciona con la evolución del pH en el medio, ya que la disminución en el pH coincidió con la actividad más baja de esta etapa, mientras que el incremento del mismo hacia el final del cultivo fue coincidente con en aumento de la actividad exopectinolítica que determinó la segunda etapa de este cultivo (Figura 11 B).
La evolución en la producción de exopectinasas sugiere, en primera instancia, la existencia de al menos dos grupos de pectinasas del tipo exo, cuya producción pudiera estar modulada por
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 74 condiciones distintas de pH. Comportamientos similares se han reportado para las poligalacturonasas de otros hongos patógenos de plantas, como Botrytis cinerea, que produjo tres isoformas (pI de 4.9, 7.6 y 7.8) en el medio de pH 3, y cuatro (pI de 7.1, 7.4, 7.6 y 7.8) en los medios con pH de 7.0. En ambos casos el pH del medio evolucionó libremente a lo largo del cultivo (Manteu et al, 2003). Por su parte, para diferentes especies de Aspergillus, se ha reportado la secreción de exopectinasas con distintos valores de punto isoeléctrico y pH óptimo, que sugieren la expresión de isoformas con esta actividad en dependencia con el pH del medio (de Vries y Visser, 2001).
La acidificación del medio podría deberse a la producción de ácidos orgánicos, como resultado del metabolismo básico del hongo. El ácido oxálico se ha reportado como uno de los principales factores involucrados en la patogenicidad de los microorganismos invasores de las plantas y los frutos cítricos, al proveer a las poligalacturonasas un pH adecuado y potencializar su acción, mediante la quelación de los iones de calcio presentes en la estructura de la pectina (Manteu et al, 2003; Favaron et al, 2004). En el hongo Sclerotinia sclerotirum, la secreción de ácido oxálico es paralela a la expresión de las isoformas ácidas de las poligalacturonasas, y una de las funciones de éste es disminuir el pH del medio hasta el valor óptimo para la actividad de las poligalacturonasas del tipo exo (Favaron et al, 2004). En Aspergillus, la función de la producción de ácido oxálico aún no es del todo clara, aunque se ha correlacionado con la movilización de los sustratos a partir de los polisacáridos de la pared celular de las plantas, debido a su capacidad quelante del calcio (Ruijter et al, 1999).
En lo que se refiere a la producción de endopectinasas, esta sólo se observó en el medio que inició en pH de 3.5, donde el inicio de la producción coincidió con el valor más bajo de pH en el mismo (Figura 11 C).
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 75 B 0 5 10 15 20 25 E x ope c ti n as as ( U g d e bi om a s a -1) C 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 E n d ope c ti n as a s ( U g d e bi om a s a -1) D 0 5 10 15 20 25 0 20 40 60 80 Tiempo (h) P e c ti n l ia s as (U g de b io m as a-1) A 0 1 2 3 4 5 6 pH
Figura 11. Evolución del pH (A), la producción de exopectinasas (B), endopectinasas (C) y pectin liasas (D) en cultivos en lote de A. flavipes FP-550 desarrollados a nivel biorreactor con pectina al 1% (p/v) como única fuente de carbono, con valores de pH inicial de 3.5 (¡) y 5.0 (S).
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 76 En la sección 5.2.1 se sugirió que la producción de la actividad endopectinolítica podría inducirse por los productos de la acción previa de las exopectinasas. Sin embargo, a pesar de que la producción de exopectinasas en los dos valores de pH inicial fue muy semejante (Figura 11B), la de endopectinasas fue considerablemente distinta (Figura 11C). La diferencia en la producción de las pectinasas del tipo endo pudiera deberse a la concentración máxima de azúcares reductores producidos en cada caso (1.9 y 2.7 g L-1, respectivamente). Por un lado, una concentración elevada de estos (mayor que 2.5 g L-1) podría tener un efecto sobre la producción de la actividad endopectinolítica, como se reportó para las pectinasas de A. niger (Panda et al, 2004). Como la producción de exopectinasas en ambos cultivos fue semejante, es probable que existan en cada caso diferentes isoformas con esta actividad pectinolítica, que sean las que determinan la cantidad y tipo de azúcares reductores producidos. A su vez, esto tendría un efecto sobre la producción de endopectinasas, como ya se había propuesto. Por otro lado, es posible también que la producción de endopectinasas esté influenciada únicamente por el pH inicial del medio. Para discernir entre el efecto ejercido por cada uno de estos dos factores, fue necesario el desarrollo de experimentos adicionales, que se discuten en la sección 5.3.2.
La producción de pectin liasas mostró diferencias respecto al pH inicial del cultivo, siendo considerablemente mayor la obtenida en los medios que iniciaron en un pH de 5.0 (Figura 11 D). Como sucedió con las exopectinasas, durante las primeras 24 h de cultivo se observó una primera etapa de producción de esta actividad pectinolítica, cuyo valor máximo se obtuvo alrededor de las 20 h en ambos casos (Figura 11 D), durante las que sucedió una disminución en el pH del medio (Figura 11 A). Cuando el pH comenzó a aumentar, comenzó la segunda etapa de producción donde se observó también un incremento en la producción de pectin liasas, que fue más evidente en el medio de pH inicial igual a 5.0 (Figura 11 D). El comportamiento anterior refuerza la hipótesis que sugiere la regulación en la expresión de pectin liasas por valores de pH tendientes a
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 77 la neutralidad, y que concuerdan con lo reportado ampliamente para la producción de pectin liasas por hongos filamentosos (Peñalva y Arst, 2002). Los dos máximos de actividad observados en cada caso sugieren además la posibilidad de que el hongo produzca isoformas de pectin liasas con distintos valores de pI, que se estarían expresando en el medio en dependencia con el pH del mismo. Esto no sería extraño, si se considera que para A. niger se han reportado al menos cuatro pectin liasas diferentes, cuyos puntos isoeléctricos van de 3.65 hasta 7.7 (de Vries y Visser, 2001).
Con base en los resultados descritos anteriormente, referentes a la relación de la evolución de los grupos reductores en el cultivo con la producción de las endo y exopectinasas, la siguiente corrida experimental se llevó a cabo utilizando ácido galacturónico como única fuente de carbono. De esta manera, se podría determinar el efecto real de uno de los principales productos de degradación de la pectina sobre la actividad de exopectinasas, así como comprobar las hipótesis referentes al efecto indirecto que tiene el pH sobre la producción de endopectinasas, hecho planteado en párrafos anteriores.
Para los cultivos en lote desarrollados con ácido galacturónico se utilizaron también dos valores de pH inicial (3.5 y 5.0). En este caso, se observó un incremento del pH a medida que el cultivo avanzaba (Figura 12 A). En cualquiera de los dos valores de pH inicial utilizado, el valor final del mismo fue ∼ 6.5. La alcalinización del medio en cultivos con ácido galacturónico es un hecho pocas veces reportado durante la producción de pectinasas por hongos del género Aspergillus, aunque sí se ha observado en otros hongos patógenos de plantas como Botrytis cinerea (Wuben et al, 2003) y Sclerotinia sclerotiorum (Cotton et al, 2003). A pesar de que el ácido galaturónico es un inductor de la actividad pectinolítica en estos hongos, en altas concentraciones podría considerarse una fuente de carbono represora (Runco et al, 2001; Panda et al, 2004). Por lo anterior, durante su metabolismo se favorecería la utilización del esqueleto de los aminoácidos
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 78 que conforman a las proteínas producidas en las primeras horas de cultivo, con la subsecuente liberación de amonio al medio, lo que provocaría la alcalinización del mismo (Peñalva y Arst, 2002). Adicionalmente, el consumo del ácido galacturónico a lo largo del cultivo podría también ser la causa de la alcalinización del medio observada en estos casos. Como el ácido galacturónico es un inductor de las pectinasas de A. flavipes FP-500, se hace necesario verificar cómo es la producción de las pectinasas en esta fuente de carbono, considerando que el pH tiene un comportamiento distinto al observado para cualquiera de las otras fuentes de carbono utilizadas. Como sucedió con la pectina, aunque el hongo creció a una velocidad semejante en estos cultivos (µ = 0.12 y 0.14 h-1
, respectivamente), se reportarán las producciones específicas de pectinasas, para facilitar la comparación e interpretación de los resultados.
La generación de exopectinasas volvió a mostrar dos etapas de producción máxima. En los cultivos que iniciaron en un pH de 3.5, la primera fase de producción se observó entre las 0 y las 38 h de cultivo, mientras que en los de pH inicial de 5.0 ésta sucedió en las primeras 36 h (Figura 12 B). En ambos casos, el valor máximo de esta primera etapa se obtuvo antes de que el pH del medio comenzara a incrementarse, mientras que la segunda etapa de la producción se observó durante el incremento del pH en el medio. En los medios que iniciaron en un pH de 3.5 pareció suceder una tercera etapa de producción máxima entre las 36 y las 54 h (Figura 12 B). Estos resultados refuerzan la sugerencia de que A. flavipes FP-500 produce varias isoformas con actividad exopectinolítica y sugiere además que la expresión de cada una está regulada por distintos valores de pH.
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 79 B 0 10 20 30 40 50 60 70 E x opec ti nas as (U g de bi om as a -1) C 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 E ndop ec ti na s a s ( U g de bi o m as a -1) D 0 5 10 15 20 25 0 20 40 60 80 100 Tiempo (h) P e c ti n l ia s a s (U g de bi om as a -1) A 0 1 2 3 4 5 6 7 8 pH
Figura 12. Evolución del pH (A), la producción de exopectinasas (B), endopectinasas (C) y pectin liasas (D) en cultivos en lote de A. flavipes FP-500 desarrollados a nivel biorreactor con ácido galacturónico al 1% (p/v) como
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 80 Por otro lado, la elevada producción específica de exopectinasas alcanzada con esta fuente de carbono, en comparación con la obtenida en pectina (Figura 11 B), confirmó el papel de esta fuente de carbono como inductor de dicha actividad pectinolítica.
La producción de endopectinasas se observó hasta después de las primeras 24 h de cultivo (Figura 12 C), cuando la concentración de ácido galacturónico había disminuido casi a la mitad de su valor inicial (datos no mostrados). La actividad endopectinolítica obtenida en el cultivo que inició en pH de 3.5 fue menor que la alcanzada en pectina en el mismo valor de pH inicial en un 30% aproximadamente, y disminuyó considerablemente hacia el final del cultivo, cuando el pH se había incrementado hasta ser mayor a 5.0 (Figura 12 A). Por otra parte, en los medios que iniciaron en un pH de 5.0, la actividad endopectinolítica se observó en dos etapas. La primera de ellas sucedió cuando el pH aún estaba por debajo de 6.0, mientras que la segunda fase se observó hacia el final del cultivo, cuando el pH en el medio era cercano a la neutralidad (Figura 12 C). Los resultados obtenidos sugieren que la actividad de endopectinasas está regulada tanto por el ácido galacturónico como por el pH ácido en el medio, y que como sucede con otros hongos saprófitos, como Botrytis cinerea (Wubben et al, 2003), A. flavipes FP-500 codifica para diferentes isoformas de endopectinasas, que se sintetizan en dependencia del pH del medio. De hecho, en el grupo de trabajo, los electroforegramas y zimogramas desarrollados a muestras obtenidas ante distintas condiciones de producción han reportado diferencias que apoyarían esta hipótesis. Sin embargo, sería necesario hacer un análisis electroforético y zimográfico muy específico de los cultivos aquí reportados, para comprobar dicha hipótesis.
La producción de pectin liasas no se observó en los medios que iniciaron en el pH de 3.5 durante las primeras 60 h, y después esta fue muy baja (Figura 12 D). Sin embargo, la producción obtenida en los medios con pH inicial de 5.0 fue semejante a la observada en pectina en las mismas condiciones de cultivo (Figura 12 D). En este caso hubo también dos etapas de
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Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 81 producción máxima en la actividad de pectin liasas. La mayor producción se observó cuando el pH en el medio era mayor que 5.0, es decir, durante la segunda fase del cultivo (Figura 12 D). Este comportamiento confirma que la producción de pectin liasas sucede preferentemente en los medios con valores de pH mayores a 5.0, y que este parámetro tiene la mayor influencia sobre la producción de las pectin liasas de A. flavipes FP-500.