94 4.3.4.2 X-ray diffraction analysis (mineralogy)
4.3.6 Scanning Electron Microscopy (SEM)
Recuento de microorganismos
aerobios mesófilos (31 ± 1 °C)
revivificares
14 MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
Recuento por siembra en masa Material
— Placas de Petri estériles de 90 mm. — Pipetas de 10 y 1 ml.
— Asa de siembra.
— Asas de vidrio estériles. — Estufa de cultivo. — Contador de colonias. Medio de cultivo
Agar nutritivo de recuento (Plata Count Agar. PC A) Composición: Triptona 5 g Extracto de levadura 2,50 g Dextrosa 1 g Agar 12 g Agua destilada 1.000 ml
Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento. Ajustar el pH a 7. Dis- tribuir en tubos o matraces y esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Técnica
— A partir de la «serie de diluciones decimales» y por duplicado, depositar, con pipeta estéril, 1 mi de cada dilución en otras tantas placas de Petri es tériles de 90 mm de diámetro.
— Añadir a cada placa unos 15 mi de PC A (v. pág. 14) previamente licuado y atemperado a 47 ° C.
El tiempo transcurrido entre el momento de depositar las distintas di- luciones en las placas y verter sobre ellas el medio de cultivo no debe ser superior a 10 minutos. Del mismo modo, no se superarán los 20 minutos desde que se prepara la primera dilución en la «serie de diluciones deci- males»hasta que se vierte el agur en la última placa.
— Mezclar perfectamente medio e inoculo sobre la mesa de trabajo, hacien- do movimientos circulares con la placa, a favor y en contra del sentido de las agujas del reloj y en forma de cruz, evitando al mismo tiempo que el medio impregne la tapa. Dejar solidificar el agur de las placas sobre una superficie horizontal.
Cuando se ha solidificado perfectamente el agur, se invierten las placas y se introducen en la estufa, evitando que se apilen en exceso y que entren en contacto con sus paredes. Incubar a 31 ± 1 ° C durante un período de 72 horas.
— Transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias en aquellas placas que muestren entre 30 y 300 colonias aisladas. Las colonias conta- das se irán marcando para evitar contarlas de nuevo.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS (31 ± 1 ° C) REVIVIFICABLES 15
El número total de colonias contadas, multiplicado por el factor de di- lución de la placa elegido, da como resultado el recuento total de gérmenes por gramo o mililitro de la muestra analizada.
Recuento por siembra en superficie Material (v. pág. 14) Medio de cultivo (v. pág. 14) Técnica
— En varias placas de Petri estériles se vierten unos 15 ml de agur nutritivo de recuento (v. pág. 14), previamente licuado y enfriado a 47 ° C, y que se deja que se solidifique en una superficie horizontal.
— Para secar la superficie del agur, se introducen las placas abiertas en la es- tufa, colocando la parte que lleva el agur en posición invertida y apoyada en la tapa. Estarán dispuestas para el uso cuando se haya secado el agua de condensación de la superfcie. Nunca se deben secar a temperatura superior a 45 °C.
— Partiendo de la «serie de diluciones decimales», y por duplicado, se trans- fiere 0,1 ml de cada una de las diluciones a placas con agur nutritivo PCA. Desechar la pipeta utilizada. El inoculo se disemina por toda la su perficie del agur, sin romperlo, con ayuda de un asa de vidrio estéril. De- sechar el asa de vidrio utilizada.
— Dejar que el inoculo sea absorbido y colocar todas las placas en estufa re- gulada a 31 ± 1 ° C, evitando que estén apiladas en exceso y que entren en contacto con las paredes de la estufa. El periodo de incubación será de 72 horas.
— Transcurrida la incubación, se hace el recuento de colonias en las placas donde estén perfectamente aisladas.
El número total de colonias contadas, multiplicado por el factor de di- lución de la placa elegido, da como resultado el recuento total de gérmenes en 0,1 g del producto analizado. Esta cifra, multiplicada por 10, expresa- rá el recuento total de gérmenes por gramo o mililitro.
Las Enterobacteriaceae lactosa-positivas o grupo coli-aerogenes constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aisla- miento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriace- ae v se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una tem- peratura de incubación comprendida entre 3O-37° C.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo «coliformes» forman parte varios géneros:
— Escherichia. — Enterobacter. — Klebsiella. — Citrobacter.
Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.
Aunque su especificidad como indicadores no es buena, se suelen usar como índice de contaminación fecal por:
— Su frecuencia en heces.
— Su fácil detección en el laboratorio.
— Sus características semejantes, en algún aspecto, a las de algunos miem- bros patógenos de la familia Enterobacteriaceae.
Dentro de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sa- nitario y, por consiguiente, los que más interesan en el análisis microbiológico de alimentos.
Se considera a los coliformes fecales como presuntos Escherichia coli. Sus principales características son:
— Aptitud para desarrollarse entre 43,5-45,5 ° C. — Capacidad para crecer en presencia de sales biliares. — Facultad para producir indol en agua de peptona.
17
Investigación y recuento de
Enterobacteriaceae lactosa-
positivas (coliformes)
18 MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
En general, niveles altos de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (colifor- mes) indican manipulación y elaboración deficientes de los alimentos.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE LACTOSA-POSITIVAS (COLIFORMES)
Investigación y recuento en medio líquido
Para la detección de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes), se aprovechan ciertas características que las diferencian de otras Enterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con producción de áci- do y gas en presencia de sales biliares.
Material — Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. — Gradillas. — Pipetas estériles de 10 y 1 ml. — Estufa de cultivo. Medio de cultivo
Caldo lactosado biliado verde brillante (Brilliant Green Bile Lactose: BGBL) Composición: Peptona 10 g Lactosa 10 g Bilis de buey 20 g Verde brillante 0,0133 g Agua destilada 1.000 ml
Disolver. Ajustar el pH a 7,4. Distribuir en tubos de ensayo con campana Dur- ham a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 20 minutos. Técnica
Se preparan en una gradilla tres series de tres tubos cada una. Cada tubo contendrá 10 mi de BGBL (véase apartado anterior).
En cada uno de los tubos de la primera serie, se vierte 1 mi de la dilución de la muestra al 1:10.
En cada uno de los tubos de la segunda serie, se vierte 1 mi de la dilución de la muestra al 1:100.
En cada uno de los tubos de la tercera serie, se vierte 1 mi de la dilución de la muestra al 1:1.000.
Incubar las tres series a 31 ± 1 ° C, haciendo lecturas a las 24 y 48 horas. La reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la cam- pana Durham, por lo menos en 1/10 parte de su volumen, como consecuencia de la fermentación de la lactosa con formación de ácido y gas en presencia de sales biliares a una temperatura comprendida entre 30-37 ° C.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE LACTOSA-POSITIVAS 19
Con el número de tubos positivos en cada serie, se recurre a la Tabla del Nú- mero Más Probable (NMP), donde se obtendrá el recuento por gramo o mililitro de muestra.
Tabla del Número Más Probable (NMP) por gramo o mililitro utilizando tres series de tres tubos cada una, conteniendo 10 ml de medio líquido y sembrando 1 ml
de la dilución 1:10, 1 mi de la dilución 1:100 y 1 mi de la dilución 1:1.000
Tres tubos Tres tubos Tres tubos NMP de
1 ml 1 ml 1 ml gérmenes 1:10 1:100 1:1.000 g o ml 0 0 0 <3 0 0 1 3 0 1 0 3 1 0 0 4 1 0 1 7 1 1 0 7 1 1 1 11 1 2 0 11 2 0 0 9 2 0 1 14 2 1 0 15 2 1 1 20 2 2 0 21 2 2 1 28 3 0 0 23 3 0 1 39 3 0 2 64 3 1 0 43 3 1 1 75 3 1 2 120 3 2 0 93 3 2 1 150 3 2 2 210 3 3 0 240 3 3 1 480 3 3 2 1.100 3 3 3 >2.400
Investigación y recuento en medio sólido
En la técnica que se describe a continuación se utiliza el medio selectivo agur biliado rojo neutro cristal violeta (Violet Red Bile Agar: VRBA).
20 MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA Material
— Placas de Petri estériles, de 90 mm de diámetro. — Pipetas estériles de 1 ml.
— Estufa de cultivo. — Cuenta colonias. Medio de cultivo
Agar biliado-rojo neutro-cristal violeta (Violet Red Bile Agar: VRBA) Composición: Extracto de levadura 3 g Peptona 7 g Cloruro sódico 5 g Sales biliares 10 g Lactosa 5 g Rojo neutro 0,03 g Cristal violeta 0,02 g Agar 15 g Agua destilada 1.000 ml
Disolver los ingredientes por calentamiento. Mantener en ebullición dos mi- nutos. Ajustar el pH a 7,4. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Para preparar placas de Petri, se enfriará a 45 ° C.
Técnica
A partir de la «serie de diluciones decimales» (v. pág. 11) y por duplicado, se añade 1 mi de cada dilución en placas de Petri estériles, a continuación se vierten unos 15 mi de agar VRBA (véase apartado anterior) atemperado a 47 ° C. Mezclar cuidadosamente. Una vez solidificado el medio en una superficie horizontal, se vierten 3-4 ml del mismo medio estéril sobre cada placa, formando una capa que evita el excesivo crecimiento y la extensión de las colonias, lo que facilita su re- cuento. Incubar las placas en posición invertida a 31 ± 1 ° C durante 24 horas.
Las sales biliares y el cristal violeta del medio inhiben la ñora acompañante grampositiva. La fermentación de la lactosa hace que vire el indicador rojo neutro a un color rojo púrpura. También se produce una precipitación de las sales bilia- res.
La lectura consiste en contar las colonias rojo púrpura rodeadas de una zona de precipitación de las sales biliares color violeta.
Para el recuento se eligen placas que contengan entre 30 y 150 colonias típicas El número de colonias contadas, multiplicado por el factor de dilución de la pla- ca elegido, da como resultado el número total de Enterobacteriaceae lactosa-po- sitivas (coliformes) por gramo o mililitro de muestra.
Escherichia coli es huésped constante del intestino del hombre y de los ani- males de sangre caliente. Por su especificidad está considerado como un buen ín- dice de contaminación fecal. Tiene el inconveniente de vivir poco tiempo en el ambiente extraentérico, por lo que su presencia en los alimentos indica contami- nación reciente.
Se destruye a temperatura de pasteurización y también durante su almacena- miento en frío, sobre todo a temperatura de congelación.
Su escasa resistencia hace que no sea un buen indicador de flora patógena; así, por ejemplo, es mucho menos resistente que la Salmonella a las condiciones ambientales y a la acción del frío.
Pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Es un germen de forma bacilar, casi siempre móvil, gramnegativo. Posee estructura antigénica.
La mayoría de las bacterias pertenecientes a la especie E. coli, forman parte de la microflora normal del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente, encontrándose, habitualmente, en sus heces. Su detección en los alimentos sirve como índice de contaminación fecal de los mismos. La mayor parte de las cepas son inocuas, pero existen algunas que son patógenas para el hombre.
Al final del siglo pasado se comprobó que algunas cepas de E. coli eran la causa de diarreas en niños, lo que fue comprobado en 1950 por Kauffmann y Du- pont. Se prosiguieron los estudios y Lupski y Feigin, en 1988, sugieren que este grupo de E. coli patógenos se denomine, en general, Escherichia coli enteroviru- lentos (Enteric Virulent Escherichia coli: EVEC).
Existía la creencia de que E. coli enterovirulento (EVEC) afectaba, única- mente a bebés y niños en general. Es a partir de 1952 cuando se comprueba que los adultos también sufren con cierta frecuencia diarrea por E. coli:
Cepas E. coli enterotoxigénicas (ECET): Muchas cepas de E. coli elaboran una toxina lábil (LT) y/o una toxina estable (ST). La toxina lábil (LT), se inactiva a temperatura de 60 °C aplicada durante 30 minutos; la toxina estable (ST) resis- te más de 100 °C aplicados durante 30 minutos.
El germen actúa colonizando el epitelio del intestino delgado, donde elabora la o las toxinas. La toxina lábil (LT) rompe la función celular del epitelio intestinal, produciendo secreción de agua y electrólitos que vierten en la luz intestinal pro-
21
Investigación y recuento de
Escherichia coli
22 MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
duciendo diarrea acuosa profusa. La toxina termoestable (ST), menos estudiada, probablemente actúa de forma análoga.
Estas toxinas son causa de la diarrea infantil, así como de la denominada dia- rrea de los turistas. Los síntomas de la enfermedad dependen de la toxina impli- cada. En el caso de la toxina lábil (LT), los síntomas se asemejan a los del cólera. Los brotes por toxina estable (ST) son menos frecuentes.
Los síntomas producidos por las cepas E. coli enterotoxigénicas (ECET), se inician entre las 8 y 44 horas que siguen a la ingestión del producto contaminado con el germen. La enfermedad se manifiesta con una diarrea acuosa, no sangui- nolenta, a veces con mucosidad. Hay retortijones, dolor abdominal, malestar ge- neral, nauseas, vómitos y, si se origina fiebre, ésta es leve. Los síntomas duran en- tre 3-9 días.
De las cepas E. coli enterovirulentas (EVEC) existen portadores asintomáticos que pueden contagiar a niños y adultos, sobre todo en casas con condiciones hi- giénicas deficientes, guarderías, residencias, etc. por la misma causa.
Aunque E. coli es un microorganismo habitual del intestino humano y otros animales, las cepas que producen diarrea, exceptuando las enterohemorrágicas, son de origen humano. En cuanto a los alimentos, la transmisión de cepas ente- rotoxigénicas que han dado origen a enfermedad están en el agua de bebida, leche, ensaladas vegetales, queso de pasta blanda, etc.
Cepas E. coli enteroinvasivas (ECEl): dentro de los E. coli enterovirulentos (EVEC), las cepas enteroinvasivas del mismo (ECEI), además de poseer las pro- piedades comunes de los otros tipos patógenos tienen, por otra parte, ciertas pro- piedades atípicas que se relacionan con las Shigella (inmovilidad, similitud bio- química, algunas cepas no producen gas de la glucosa ni de otros azúcares, su fermentación lenta de la lactosa).
Las cepas citopatogénicas penetran en el intestino e invaden las células epite- liales del colon donde se multiplican y producen su muerte. Esto da lugar a la pro- ducción de ulceraciones cuya consecuencia es una diarrea sanguinolenta. La en- fermedad que producen estas cepas es más grave que la de cepas enterotoxi- génicas (ECET).
Los síntomas que ocasionan las cepas E. coli enteroinvasivas (ECEI) aparecen entre las 8 y 24 horas posteriores a su ingestión. Se manifiestan con escalofríos, malestar, dolor de cabeza, mialgia, fiebre, retortijones abdominales y diarrea profusa sanguinolenta. Es muy parecido a la Shigella y, en su identificación, se puede confundir con ella. La enfermedad dura días y, aun, semanas. No se cono- ce bien la existencia de portadores asintomáticos de cepas ECEI. Su transmisión se hace de persona a persona por manipulaciones poco higiénicas y falta de hi- giene personal, también a través de agua, leche, queso, carne de ave y otros.
Cepas E. coli entewpatógenas (ECEP): dan lugar a una patología entérica muy parecida a la de las cepas enterotoxigénicas (ECET). Se trata de un gran nú- mero de tipos de E. coli. Han sido la causa de numerosos brotes en guarderías y otras comunidades infantiles donde no se contaba con buenas condiciones higié- nicas. Son los niños los más afectados. La enfermedad es más frecuente en países subdesarrollados, con condiciones de vida muy deficientes. Los clásicos tipos de dispepsia infantil por E. coli pertenecen a este grupo. Se han citado algunos casos en adultos, aunque excepcionalmente, ya que parece que las personas van adqui- riendo inmunidad con el transcurso del tiempo.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI 23
Al llegar al intestino se adhieren al epitelio intestinal y destruyen los microvilli lesionándolos, pero sin invadir los tejidos. Los síntomas se inician entre las 17 y 72 horas que siguen a la ingestión del germen. Se manifiestan con dolor abdomi- nal, vómitos, fiebre, diarrea acuosa con abundante moco pero sin sangre. La en- fermedad dura entre 1 y 12 horas. Su transmisión se puede producir de persona a persona a través de portadores humanos asintomáticos que contagian a niños y an- cianos por falta de higiene (guarderías, residencias, países subdesarrollados). A través de alimentos se conocen brotes producidos por consumo de queso de pasta blanda, agua, carne y otros.
Cepas E. coli enterohemorrágicas (ECEH) (O157:H7): las cepas E. coli en- terohemorrágicas (ECEH), serovar 0157:H7 son, probablemente, las más impor- tantes entre los E. coli enterovirulentos (EVEC) alimentarios. El tipo predomi- nante en estas cepas es el serovar 0157:H7 y la toxina involucrada en la enfermedad se denomina verotoxina.
La presencia de E. coli serovar 0157:H7 se identifica como causa de colitis hemorrágica que, con frecuencia, se asocia con la ingestión de carne picada va- cuna poco cocinada, principalmente, aunque pueden tenerse en cuenta también otras carnes de abasto (cerdo, ovino y aves). El germen, después de ingerido, co- loniza en el intestino grueso, dando lugar a varias formas de manifestación pa- tógena:
— Colitis hemorrágica.
— Síndrome hemolítico urémico (Hemolytic Uremic Syndrome: HUS). — Púrpura trombótica trombocitopénica (Thrombotic Thrombocytopenic
Purpura: TTP).
En la colitis hemorrágica se produce dolor abdominal, a veces vómitos, diarrea acuosa sanguinolenta y poca o ninguna fiebre. Los síntomas aparecen a los 3-9 días después de la ingestión del alimento contaminado. La enfermedad dura 2-9 días.
En el síndrome hemolítico urémico (HUS), hay diarrea sanguinolenta y, so- bre todo en niños, fallo renal agudo que puede terminar en muerte. No hay fiebre.
La púrpura trombótica trombocitopénica (TTP) es, en cierto modo, parecida al síndrome hemolítico urémico (HUS), no hay fiebre, existe hemorragia gastroin- testinal y, en este caso, puede ser afectado el sistema nervioso central. A los en- fermos se les pueden formar coágulos en el cerebro, con el peligro de muerte. Como esta cepa procede, principalmente, del ganado vacuno son, la carne poco cocinada, sobre todo la picada y la leche cruda los alimentos más involucrados en esta enfermedad. Los brotes son más frecuentes en guarderías, residencias de an- cianos etc. por la mayor sensibilidad de estos seres. En todos los casos la apari- ción de la enfermedad se corresponde con falta de higiene.
E. coli serovar 0157:H7 tiene unas características propias que se pueden usar en su aislamiento e identificación:
— No fermentan el sorbitol.
— No producen la enzima beta de la glucuronidasa (en la prueba MUG estas cepas no dan fluorescencia por carecer de la enzima citada).
24 MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA Escherichia coli se ajusta a las siguientes características:
Prueba Reacción
Movilidad + (casi siempre)
Indol + Rojo de metilo + Voges Proskauer - Betagalactosidasa + Citrato de Simmons - SH2 - Lisina + Urea - Fermentación de la glucosa + Fermentación de la lactosa + Material — Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. — Gradillas. — Asa de cultivo. — Baño María. — Placas de Petri de 90 mm. — Pipetas de 1 ml. — Estufa de cultivo.
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
Caldo lactosado biliado verde brillante (Brilliant Grcen Bile Lactose: BGBL) (v. pág. 18) Agar Levine Composición: Peptona 10 g Lactosa 10 g Fosfato dipotásico 2 g Eosina 0,40g Azul de metileno 0,065 g A g a r 1 5 g Agua destilada 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,1. Distribuir y esterilizar en au- toclave a 121 ° C durante 15 minutos. Atemperar para preparar placas de Petri.
INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI 25
Agua de triptona (Tryptone Water: TW) (v. pág. 11) Reactivo de Kovacs
Composición:
Paradimetil-amino-benzaldehído 5 g
Alcohol amílico 75 ml
Acido clorhídrico puro 25 ml
Se disuelve el aldehído en el alcohol, calentando a 60 ° C en baño Maria. Dejar enfriar y añadir, gota a gota, el ácido. Se obtiene un líquido de color ama- rillo dorado que debe conservarse en frasco topacio, al abrigo de la luz y en fri- gorífico.
Agar nutritivo (Plata Count Agar: PCA) (v. pág. 14) Medio de Clark y Lubs (MR-VP)
Composición:
Peptona 7 g
Glucosa 5 g
Fosfato dipotásico 5 g
Agua destilada 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 6,9. Distribuir en tubos de 16 x 160 mm a razón de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
Reactivo para la prueba rojo de metilo Composición:
Alcohol de 90° 65 ml
Agua destilada 35 ml
Rojo de metilo 0,20 g
Se disuelve el colorante en el alcohol y se completa con el agua destilada.
Reactivos para la investigación de acetil-metil-carbinol (prueba de Voges Proskauer: VP)
Composición: Reactivo A:
Alfa-naftol 40 g
26 MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
La solución se conserva en oscuridad. Reactivo B: Hidróxido potásico 40 g Agua destilada 100 ml Creatinina Agar citrato de Simmons Composición: Sulfato magnésico 0,20 g
Dihidrógeno fosfato amónico 0,20 g Fosfato sódico amónico 0,80 g
Citrato sódico 2 g
Cloruro sódico 5 g
Azul de bromotimol 0,08 g
Agar 15 g
Agua destilada 1.000 ml
Disolver por calentamiento hasta ebullición. Ajustar el pH a 7. Distribuir en tubos de 16 x 160 mm a razón de 7 mi. Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Dejar solidificar con una inclinación que permita obtener un fondo de 2-3 cm y una superficie inclinada de 4-5 cm.
Caldo lauril sulfato (MUG) Composición: Triptosa 20 g Lactosa 5 g