Alignment Algorithm

4.1.5.1. Diseño del siRNA

La eficiencia del proceso del RNAi depende en gran medida del grado de homología entre el siRNA y la secuencia del gen blanco, por lo que la secuencia que ha de ser incluida en el siRNA debe ser cuidadosamente seleccionada para evitar la interferencia entre secuencias homólogas de genes relacionados. Además, los siRNA tienen que ser diseñados a partir secuencias exónicas ya que como se expuso anteriormente, no se ha visto ningún efecto en la expresión génica cuando se han usado siRNA diseñados a partir de secuencias intrónicas (Tuschl, et al., 1999; Bueno et al., 2001). Hoy en día existen programas especiales que ayudan al diseño de los siRNAs basados en el porcentaje de homología con el gen de interés. En línea existen diversas herramientas de libre acceso para el diseño de siRNAs que utilizan algoritmos para seleccionar cuidadosamente la secuencia blanco. La mayoría de ellos están basados en literatura actual que señala ciertas propiedades importantes que el siRNA que se está diseñando debe tener para asegurar un silenciamiento eficiente. Entre estas se encuentran el tamaño de la molécula de siRNA (~25 nt), una perfecta complementariedad con la secuencia

blanco, bajo contenido de GC (30-52%), una baja estabilidad interna en el extremo 3´, ausencia de secuencias invertidas repetidas, entre otras (Elbashir et al., 2001a, 2001b; Reynolds et al., 2004). Estas propiedades han sido seleccionadas ya que permiten que la moléculas de siRNA activen eficientemente la maquinaria de RNAi facilitando cuatro pasos principales de este mecanismo: 1) el ensamblaje de la cadena guía a RISC, 2) la activación de RISC, 3) el reconocimiento del mRNA blanco y 4) su subsiguiente degradación (Reynolds et al., 2004). Al seguir estas simples reglas en el diseño del siRNA, se asegura un silenciamiento génico más eficiente.

Figura 42. Mecanismos de interferencia. Las dos vías de interferenica se indican con los

números I y II y los pasos de cada vía se señalan con letras. I. Formación de los

siRNAs: a) presencia de un RNA de doble cadena (dsRNA) en el citoplasma, b)

procesamiento por Dicer, c) desenrollamiento del siRNA por una helicasa d) formación de RISC tras la incorporación de Ago2 y de la cadena guía que se aparea con el mRNA blanco el cual, es degradado por medio de Ago2. II. Síntesis de microRNA: a) Transcripción del gen del miRNA por la RNApol II, b) procesamiento por Drosha en el núcleo, c) exportación de la molécula de pre-microRNA del núcleo al citoplasma por exportina-5, d) procesamiento por Dicer, e) desenrollamiento del dsRNA por una helicasa, f) formación de RISC tras la incorporación de Ago2 y de la cadena guía que se aparea con el mRNA blanco y dependiendo del grado de complementariedad, represión de la traducción o g) degradación del mRNA por Ago2.

4.1.5.2. Estrategias de bloqueo

En vertebrados existen dos tipos de ensayos de RNAi, los transitorios, donde la expresión del gen es reprimida sólo temporalmente y los estables, en donde las células u organismos permanecen interferidos por un periodo de tiempo más largo.

a) Ensayos transitorios. En este caso, se utilizan moléculas de siRNA sintetizadas químicamente y son introducidos a las células donde la maquinaria de RNAi celular se encargará de silenciar la expresión del gen. La respuesta será proporcional a la cantidad de moléculas de siRNA utilizadas, por lo que se dice que la respuesta es temporal. Esta respuesta transitoria es debida a que las células de vertebrados carecen de un mecanismo de amplificación de la respuesta del RNAi que se ha visto en organismos como D. melanogaster y C. elegans. (Shi, 2003). Esta estrategia ha mostrado ser muy eficiente tanto en cultivos celulares como en cultivo de órganos, sin embargo cuando la proteína a bloquear es muy estable o abundante se recomienda usar los ensayos estables.

b) Ensayos estables. En este tipo de ensayos, se requiere que las células incorporen a su genoma los elementos necesarios para fabricar los siRNAs. Esto se logra a partir de vectores que transcriban moléculas de RNA precursoras bajo el control de la RNA pol III. Estas moléulas de RNA precursoras poseen la estructura de tallo-asa y son conocidos como “small hairpin RNA” (shRNA). Los shRNA se asemejan a los pre-miRNA pero su estructura es más sencilla. Sin embargo, pasan por el mismo proceso que éstos últimos, es decir, una vez en la célula, éstos son procesados por Dicer para formar los siRNAs (Shi, 2003; Cullen, 2005). Otra estrategia que es utilizada en los ensayos estables en células de mamíferos es el uso de vectores de expresión bajo el control de la RNA pol II que transcriben secuencias de pre-miRNA conocidas, pero que pueden ser rediseñadas. En particular, la secuencia del tallo del pre-miRNA es sustituida por la secuencia del gen que se pretende silenciar, pero es esencial conservar la secuencia que forma el asa o loop terminal, de tal manera que no perturbe la maduración del miRNA y lograr así una alta eficiencia en el silenciamiento. La ventaja de esta estrategia es que se asemeja mucho al proceso natural, ya que los miRNAs naturalmente son sintetizados por la RNA pol II, además son secuencias muy similares a las sintetizadas de manera natural. La desventaja es que su aplicabilidad se reduce a células de humano y ratón principalmente, ya que es

de estos organismos que se conoce ya un número considerable de miRNAs (Cullen, 2005).

4.1.5.3. Introducción del siRNA

Una alta eficiencia en el silenciamiento génico dependerá en gran media del mecanismo por el cual estas moléculas sean introducidas a las células. En este caso también hay diferencias fundamentales que dependen del organismo con el que se esté trabajando. Por ejemplo, en insectos es posible simplemente sumergir al organismo en una solución con el dsRNA y éste penetrará en la célula, ya que en los insectos existen transportadores de dsRNA que permiten tomar ésta moléculas del medio extracelular e introducirlas a la célula. En el caso de C. elegans, se puede alimentar al gusano con bacterias que produzcan el dsRNA (Hammond et al., 2001). Pero en vertebrados la introducción de estas moléculas es más complicada y la estrategia dependerá de tipo de célula, tejido u organismo con el que se esté trabajando.

In vitro, una estrategia muy utilizada ha sido la microinyección que si bien es eficiente porque los siRNAs son depositados directamente al citoplasma celular, es una técnica muy especializada y requiere de mucho precisión (López et al., 2007). Otra alternativa es la transfección mediada por lípidos, conocida también como lipofección. Esta técnica consiste en la introducción de los siRNAs o vectores plasmídicos al espacio intracelular por medio de liposomas que entran en la célula vía endocitosis. Este es un sistema de transporte muy prometedor debido a su baja toxicidad y alta eficiencia y para esto están disponibles comercialmente productos como la oligofectamina y la lipofectamina (McManus & Sharp, 2002). La eficiencia de la transfección depende en gran medida del tipo celular con el que se esté trabajando, es por esto que en células difíciles de transfectar, también es común usar la electroporación, la cual por medio de un campo eléctrico aplicado externamente promueve un aumento significativo de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular, lo que facilita la introducción de los plásmidos al interior de la célula. Este método genera altas tasas de transfección (>95%), sin embargo alrededor del 50% de las células pueden morir durante la transfección (McManus & Sharp, 2002). Adicionalmente la introducción de los siRNAs por medio de cadenas molde de DNA ya sea como shRNA o miRNA, puede

llevarse a cabo por medio de vectores virales, lo que puede facilitar la introducción de los vectores a las células y tejidos que de otra forma son difíciles de transfectar (Shi, 2003). Se han desarrollado varios vectores virales, en particular derivados de adenovirus, retrovirus y lentivirus. Otra ventaja de los vectores virales es que pueden ser utilizados para ensayos in vivo, lo cual es muy interesante cuando se trata de analizar la función de un gen en un sistema completo (Dorsett & Tuschl, 2004; López et al., 2007). In vivo, las estrategias son similares ya que también se ha utilizado la inyección local o sistémica y la electroporación, pero quizá la más empleada y la que ha sido más eficiente es el uso de vectores virales (Dorsett & Tuschl, 2004).

Es difícil generalizar acerca de cuál metodología lleva al silenciamiento más efectivo ya que ésta va a variar mucho dependiendo del tipo celular, tejido u organismo ya que cada uno tendrá requerimientos diferentes para una eficiente transfección.