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2.2.1. Material Biológico

Un nido (80 huevos) de tortuga golfina, L. olivacea se obtuvieron de la playa “La Escobilla”, Oaxaca en julio del 2008 con el permiso SGPA/DGVS/05249/06 otorgado por la Subsecretaría de Gestión para la Protección Ambiental, Dirección General para Vida Silvestre, SEMARNAT. Los huevos fueron separados en dos grupos e incubados a temperatura promotora de macho (TPM, 26 °C) y de hembra (TPH, 33 °C) en el laboratorio del Dr. Horacio Merchant Larios, del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM.

Las gónadas, mesonefros y el complejo gónada-mesonefros se extrajeron por microdisección en dos estadios de desarrollo, durante el periodo sensible a la temperatura (PST, E24 y E25, macho y hembra respectivamente) y durante el periodo de diferenciación sexual (PDS, E27), de acuerdo a la metodología de Torres-Maldonado et al (2002) y se preservaron en RNAlater (Ambion) y paraformaldehído al 2% en PBS para extracción de RNA e hibridación in situ respectivamente.

Adicionalmente para la extracción de DNA genómico se utilizaron cerebros de embriones de L. olivacea donados también por el Dr. Horacio Merchant Larios y muestras de sangre de cuatro especies de tortuga marina (Lepidochelys olivacea, Chelonia mydas, Caretta caretta y Eretmochelys imbricata) donadas por el Dr. Alberto Abreu del Instituto de Ciencias del Mar y Limnología de la UNAM.

2.2.2. Obtención de secuencias nucleotídicas de los genes HoxD11 y HoxA13

El DNA genómico se extrajo a partir de cerebros y sangre de tortuga golfina y sangre de las otras tres especies por medio de la técnica de “salting out” (Miller et al., 1988), el protocolo de extracción de DNA se detalla en el anexo 1.1. Para corroborar que la extracción había sido óptima, el DNA se visualizó por medio de un gel de agarosa al 0.7% y posteriormente se amplificó el gen 18SrRNA utilizando los siguientes primers: 18SrRNA-F 5´-GTT AAT TCC AGC TCC AAT AGC GTA-3´; 18SrRNA-R 5´-GAA CTA CGA CGG TAT CTG ATC GTC-3´. A partir de regiones conservadas de secuencias de genes Hox 5´ parálogos reportadas para otros amniotas se diseñaron

primers degenerados. Para esto, las secuencias fueron extraídas de GenBank y alineadas utilizando el programa Multalin (Corpet, 1988). Se obtuvieron secuencias consenso de regiones conservadas a partir de las cuales se diseñaron primers degenerados con base al código de ambigüedades (Tabla 1) utilizando el programa PRIMER3 (Rozen & Skaletsky, 2000). Con estos primers se realizaron amplificaciones (anexo 1.2) de regiones parciales de genes HoxA 9-13, por medio de PCR a partir de DNA genómico de L. olivacea. Para cada par de primers se probaron diferentes temperaturas de alineación hasta encontrar la temperatura óptima que resultara en productos de amplificación específicos. Se obtuvieron fragmentos de diferentes tamaños, alrededor de 800-1300 pb, los cuales se ligaron al vector pGEM-T (Promega) y se introdujeron en bacterias competentes E. coli DH5α (Invitrogen) (anexo 1.3). Los plásmidos se extrajeron por lisis alcalina (anexo 1.4) y se secuenciaron utilizando un secuenciador LICOR IR2 (anexo 1.5). Una vez obtenidas las secuencias, se realizó un análisis de éstas utilizando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) del NCBI (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine) para identificar si se trataba del gen de interés, además se obtuvo la traducción conceptual de cada fragmento y se llevaron a cabo alineaciones múltiples con el programa Multalin para determinar niveles de similitud e identidad con otras especies. Con este protocolo de clonación fue posible aislar dos genes Hox 5´, HoxD11 y HoxA13. Se llevaron a cabo varios intentos para clonar otros genes de los clusters Hox9 y Hox10, pero estos no fueron exitosos. Las secuencias confirmadas de los genes HoxD11 y HoxA13 de las cuatro especies de tortugas marinas se depositaron en la base de datos GenBank.

2.2.3. PCR cuantitativo (qPCR)

El RNA total se extrajo de las gónadas de tortuga golfina utilizando Trizol, de acuerdo al protocolo del fabricante, seguido por dos digestiones con DNAsa I para eliminar cualquier contaminación con DNA genómico (anexo 1.6). La síntesis de DNA complementario se llevó a cabo con 5 µg de RNA total y la transcriptasa reversa MMLV (Promega) en presencia de primers aleatorios (anexo 1.7). Para corroborar la ausencia de DNA genómico en las muestras, se utilizó una muestra control a la que no se le agregó la enzima MMLV y posteriormente se corrió PCR utilizando los primers publicados en Torres-Maldonado et al. (2002) con las siguientes secuencias: Lo-actin-F 5’-TGG AGG

ATG ATA TTG CTG C-3’; Lo-actin-R 5’-ATC TTC TCC ATA TCA TCC CA-3’. Una vez confirmadas las secuencias nucleotídicas de los genes HoxD11 y HoxA13, de L. olivacea, se diseñaron primers específicos para cada gen que amplificaran un producto no mayor de 200 bases a partir del primer exón (dominio de transactivación) para ambos genes, esto para evitar que los primers alinearan con el homeodominio de otros genes Hox. Para la cuantificación de la expresión génica por PCR en tiempo real se utilizó el SmartCycler de Cepheid usando SYBR GREEN® para la detección de los amplicones (anexo 1.8).

Los valores de expresión relativa de cada gen se obtuvieron a través del método de CT

comparativo, normalizando los datos con la media geométrica de dos controles internos (Vandesompele et al., 2002), el gen de actina, como un control interno de un RNA mensajero (mRNA) que forma parte integral de la célula (citoesqueleto) y el gen 18S- rRNA como control interno de un gen que forma parte integral del ribosoma. Los valores de ∆CT se calcularon de acuerdo a Livak & Schmittgen (2001). Para calcular el

porcentaje de aumento o disminución de la expresión génica, los valores de ∆CT de los

tejidos en E27 (machos o hembras ya diferenciados) se calibraron con respecto a los tejidos correspondientes en periodo sensible a la temperatura incubados a TPM o TPH por medio de la fórmula 2-∆∆CT de acuerdo a Livak & Schmittgen (2001).

Para los análisis estadísticos, los valores de ∆CT obtenidos para cada gen fueron

linearizados usando la siguiente formula: 2-∆CT (Livak & Schmittgen, 2001). Para alcanzar la normalidad y homocedasticidad de los datos se realizó una transformación de raíz cuadrada y posteriormente se llevó a cabo un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y una prueba de comparación múltiple Holm-Sidak, para saber si existían diferencias significativas en la expresión relativa de cada gen entre los estadios analizados.

2.2.4. Histología

Las muestras de gónada, complejo gónada-mesonefros y embriones completos fueron fijadas en paraformaldehído 2% por 24 h a 4 ºC hasta su procesamiento. Los tejidos se deshidrataron y embebieron en parafina. Los cortes se hicieron de 5 µm. Los tejidos fueron rehidratados y teñidos con la tinción para usos generales hematoxilina-eosina

(H&E). Los cortes histológicos fueron analizados utilizando un microscopio óptico (Microscopio Olympus BX60), donde se hicieron observaciones a 100X, 400X y 600X. Posteriormente las imágenes fueron capturadas y documentadas en un sistema digital (Cámara Digital Olympus 3040 de 3.3 megapixeles).

2.2.5. Hibridación in situ

Las gónadas y los mesonefros se fijaron en paraformaldehído 2% en PBS por 24 h a 4 ºC. Posteriormente las muestras fueron deshidratadas a concentraciones crecientes de etanol, transparentadas con xilol y embebidas en parafina. Se realizaron cortes de 5 µm los cuales se colocaron en laminillas cubiertas con poli-L-lisina (Sigma) para realizar tanto el análisis histológico convencional con tinción hematoxilina-eosina como el análisis de hibridación in situ (HIS). Las sondas moleculares se generaron por transcripción in vitro utilizando T7 y SP6 RNA polimerasas y se marcaron con digoxigenina utilizando un sistema comercial de Roche Diagnostics siguiendo las instrucciones del fabricante (el protocolo detallado se encuentra en el anexo 1.9). Estas sondas se generaron a partir de plásmidos linearizados que contienen la secuencia de los dominios de transactivación de cada gen los cuales fueron amplificados con los primers que se muestran en la Tabla 4, Para la hibridación in situ, los cortes se desparafinaron con xilol y se rehidrataron en una serie de etanol a concentraciones descendentes hasta llegar a agua y luego PBS. Posteriormente, los cortes fueron permeabilizados con proteinasa K a una concentración de 10 µg mL-1 a 37 ºC durante 15 min en cámara húmeda. Después, los cortes fueron sometidos a una post-fijación en paraformaldehído al 4% en PBS por 20 min. La hibridación se llevó a cabo a 42 ºC toda la noche en cámara húmeda. Después de la hibridación, las laminillas se lavaron con SSC/SDS, se bloquearon y se incubaron con el anticuerpo anti-DIG conjugado a fosfatasa alcalina. Finalmente, la señal se visualizó incubando en NBT/BCIP y se contratiñó con café de Bismark (anexo1.10). Las laminillas se observaron al microscopio para su descripción y conjuntamente se documentaron mediante fotografía digital. Adicionalmente se hicieron observaciones a 1000x con un Microscopio Olympus BX60.

2.2.6. Apoptosis

Se utilizó la técnica TUNEL (Terminal deoxynucleotidil transferase [TdT]-mediated dUTP nick end labeling) para determinar si existe apoptosis en los ductos genitales que co-localice con la expresión de alguno de los genes estudiados. Este ensayo, se basa en la incorporación de dUTP’s marcados, por medio de la enzima terminal deoxinucleotidil transferasa (TdT), a los extremos 3’-OH de los fragmentos internucleosomales de DNA que se forman durante la apoptosis.

Para la realización de esta técnica, se utilizaron cortes de tejido de las mismas muestras destinadas para histología e hibridación in situ. Se obtuvieron cortes de 5 µm de grosor y se montaron en laminillas cubiertas con poli-L-lisina (Sigma). Los cortes se desparafinaron y rehidrataron con xilol, alcohol a diferentes concentraciones, agua destilada y PBS; posteriormente se siguieron las instrucciones del sistema comercial “TREVIGEN, TACS•XL® DAB In situ Apoptosis Detection Kit” (anexo 1.11), brevemente, los cortes fueron permeabilizados con proteinasa K a una concentración de 10 µg mL-1 a 37 ºC durante 15 min en cámara húmeda. La incorporación de los dUTPs marcados, por medio de la enzima TdT, se llevó a cabo a 37 ºC durante 1 h en cámara húmeda. Posteriormente las laminillas se incubaron con el anticuerpo Anti-BrdU asociado a biotina a 37 ºC durante 30 min en cámara húmeda. Las laminillas se lavaron con PBS y después se incubaron con una solución de streptavidina asociada a la enzima peroxidasa (HRP por sus siglas en inglés) por 10 min a temperatura ambiente. La reacción se reveló usando diaminobenzidina (DAB), sumergiendo las laminillas en una solución de DAB durante 10 min a temperatura ambiente. Finalmente los cortes se contratiñeron con verde de metilo y se observaron al microscopio para la identificación de las células TUNEL-positivas, el protocolo detallado se muestra en el anexo 1.12. Conjuntamente las laminillas se documentaron mediante fotografía digital.