Parameter Estimation for Poisson Index

Todo el trabajo experimental que se llevó a cabo para establecer el bloqueo post- transcripcional de Sox9 en T. scripta se realizó como parte de una estancia de investigación en el laboratorio de Fisiología a cargo de la Dra. Sarah L. Milton en Florida Atlantic University, Boca Raton, Florida.

4.3.1.1. Diseño de siRNAs

Con ayuda del programa de diseño de RNAi de Invitrogen se diseñaron dos secuencias específicas a Sox9 de T. scripta (GenBank EU914820.1) a partir del dominio de transactivación para evitar una unión inespecífica con otros genes con dominio HMG (Tabla 13).

Tabla 13. Secuencias de siRNA específicas diseñadas para Sox9 de T. scripta

Nombre Secuencia

siRNA-1295 5’-CAA CCC GGU CAA GUC ACC UAU AGU G-3’ siRNA-2015 5’-CCA AGG ACU GGA CUU UAC CCU UGA U-3’

4.3.1.2. Cultivo gonadal de Trachemys scripta y transfección de siRNAs

Los huevos de T. scripta fueron incubados a 26 °C, el progreso del desarrollo de los embriones fue monitoreado de acuerdo a la serie de estadios reportado por Greenbaum (2002). Cuando los embriones alcanzaron el E16, estadio en el cual esta especie entra en el periodo sensible a la temperatura (Wibbels et al., 1991), éstos fueron cuidadosamente retirados del huevo y sacrificados rápidamente. Después de varios intentos las gónadas se pudieron aislar hasta el E18, cuando las gónadas eran claramente visibles y se podían separar del mesonefros. El estadio en que las gónadas son aisladas y puestas en cultivo es muy importante ya que el silenciamiento génico post-trasncripcional se recomienda hacerlo antes o justo cuando el gen blanco comienza a elevar su expresión, de otra manera cuando la expresión génica es muy elevada el silenciamiento es menos eficiente (Beriswyl & Stoeckli, 2006). Shoemaker y colaboradores (2007a y b) mostraron que en

T. scripta, los niveles de expresión de Sox9 comienzan a elevarse a TPM en el E17 y es hasta el E19, que estos niveles son significativamente más altos a TPM que a TPH. Por lo tanto lo ideal hubiera sido aislar las gónadas en el E16 justo cuando empieza el PST. En estudios previos, Shoemaker y colaboradores (2010) logran aislar las gónadas de T. scripta desde el E16 y ponerlas en cultivo, lo que quiere decir que esto es factible sin embargo se requiere de mucha práctica y destreza manual. Una vez aisladas las gónadas estas se colocaron en membranas que se encontraban suspendidas en 600 µl de medio Opti-MEM suplementado en cajas de cultivo de 24 pozos y se incubaron a 26 °C durante 24 h antes de la transfección. Las gónadas en cultivo se lograron mantener hasta 10 días sin que hubiera muerte celular o contaminación del medio.

Para establecer un protocolo de silenciamiento génico en un sistema de cultivo gonadal se partió de lo reportado por Davies y colaboradores (2004), quien describe una metodología para bloquear genes en un cultivo renal de ratón. Se corrieron diversos ensayos en los cuales se varió la concentración de Lipofectamina, también se probaron diferentes medios de cultivo y tiempos de transfección. La eficiencia de transfección se analizó usando un plásmido de expresión de la proteína reportera GFP (“Green fluoresecent protein”; donado por el Dr. Howard Prentice). Una vez que se vio expresión de GFP en las gónadas transfectadas, se partió de este protocolo para probar con el siRNA.

Para resumir, en el presente trabajo se describió el último protocolo en que se logró el silenciamiento de Sox9. Se diseñó una curva de dosage con tres diferentes concentraciones de siRNA (100, 300 y 600 pmol mezclando ambas secuencias). La transfección se llevó a cabo con Lipofectamina como reactivo de transfección y las gónadas se incubaron a 26 °C por 72 h.

4.3.1.3. Confirmación del bloqueo post-transcripcional por Western-blot

Una vez transcurrido el tiempo de transfección, se extrajeron proteínas totales de las gónadas y se corrieron en un SDS-PAGE, posteriormente se transfirieron a una membrana de nitrocelulasa en la cual se llevó a cabo el Western-Blot. La proteína Sox9 se identificó por medio de un control positivo que era un lisado de células transfectadas

con Sox9 de humano, el cual mostraba una proteína de ~65 KD y por correspondencia en peso molecular se identificó a Sox9 de T. scripta (Fig. 43).

La transfección con el siRNA resultó en una disminución en los niveles de Sox9 de manera dosis-dependiente como se puede observar en el Western-blot de las muestras tratadas con la curva de dosage de siRNA (Fig. 43). Con la concentración de 100 y 300 pmol de siRNA se observan bandas tenues de ~65 KD, comparadas con las muestras de gónadas incubadas a TPM que no fueron tratados con el siRNA. En algunos casos (muestra 1-100 y 2-300) pareciera que la banda de Sox9 es más intensa que los controles a TPM, sin embargo, esto puede deberse a diferencias en la concentración proteica cargada en el gel, lo cual se puede corroborar con el Western-blot de β-actina. Aún más, con la concentración de 600 pmol de siRNA, la banda de Sox9, prácticamente desaparece en las tres muestras analizadas. Por otro lado, las gónada incubadas a TPH fueron utilizadas como controles negativos, ya que las hembras diferenciadas expresan bajos niveles de Sox9 (Shoemaker et al., 2007b), lo cual es consistente con los resultados del Western-blot en la muestra 1 y 3. Sin embargo la muestra 2 presenta una banda correspondiente a Sox9. Esto pudo deberse a que este embrión en particular ya se había determinado hacia la ruta testicular al momento en que llegó al laboratorio y se incubó a TPH, por lo que éste no respondió a la temperatura de incubación y se diferenció como macho, por lo tanto, sus gónadas resultaron positivas a Sox9. Aun a pesar de que estos resultados eran optimistas, no se podía descartar la posibilidad que el silenciamiento de Sox9 fuera un efecto inespecífico debido quizá a muerte celular o bien como respuesta a algún otro compuesto como pudiera ser la Lipofectamina o el mismo medio de cultivo.

En estos resultados pudimos observar un aparente bloqueo post-tanscripcional de la proteína Sox9 y fue por esto que se estableció este protocolo para el silenciamiento génico en un sistema de cultivo de gónada, como un punto de partida para poder identificar los puntos que podían mejorar para hacer más eficiente tanto el bloqueo como la corroboración del mismo, siendo estos principalmente 1) la edad de los embriones de los cuales se aislaron las gónadas para el cultivo, 2) el tiempo de transfección, 3) los controles que se podían correr para poder corroborar que el silenciamiento observado resultaba efectivamente de un efecto de los siRNAs y no de otras fuentes como pudieran

ser muerte celular, el reactivo de transfección o el medio de cultivo y 4) colectar muestras para analizar el bloqueo post-transcripcional tanto a nivel proteína, por inmunofluorescencia (que puede dar información tanto espacial como semi-cuantitativa) y a nivel mRNA, por PCR cuantitativo.

Figura 43. Confirmación del bloqueo post-transcripcional de Sox9 en T. scripta por

medio de Western-blot utilizando un anticuerpo anti-Sox9 humano. En la figura se muestra el extracto proteico de las gónadas tratadas con la curva de dosage de siRNA (100, 300 y 600 pmol), el control positivo del lisado celular (+) y de las gónadas incubadas a TPM, además del control negativo de las gónadas incubadas a TPH. En la parte inferior se muestra también el Western-blot con el anticuerpo de β-actina a manera de control de la concentración proteica cargada en el gel.