Database Scans using Poisson Index

4.3.2.1. Diseño de siRNAs

Con ayuda del programa de diseño de RNAi de Invitrogen, se diseñaron dos secuencias específicas a Sox9 de L. olivacea (GenBank GQ258676) a partir del dominio de transactivación, esto para evitar un silenciamiento no específico con otros genes con dominio HMG. Además, se diseñó una secuencia control que no fuera complementaria con ningún gen de L. olivacea. Las tres secuencias diseñadas se muestran en la tabla 14.

Tabla 14. Secuencias de siRNA específicas diseñadas para Sox9 de L. olivacea

Nombre Secuencia

siRNA-648 5’-CAG CAU GAG UGA GGU UCA CUC UCC A-3’ siRNA-860 5’-UAG AGA CCU UUG ACG UAA AUG AGU U-3’ siRNA-control 5´-UAG UCC AAG UUA UGC GUA AAG AGU U-3´

4.3.2.2 Cultivo gonadal de Lepichelys olivacea y transfección de siRNAs

De acuerdo a lo establecido anteriormente para T. scripta, los huevos de tortuga golfina recién ovipositados fueron trasladados al laboratorio del Dr. Merchant-Larios en el Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. Una parte fue incubada a 26 °C (TPM) y otra parte a 33 °C (TPH). Una vez que los embriones incubados a TPM habían alcanzado el E23 (antes del PST), las gónadas fueron aisladas y puestas en cultivo siguiendo las condiciones establecidas anteriormente para T. scripta. Inmediatamente después, se preparó la mezcla de transfección realizando también una curva de dosage de siRNA (100, 300 y 600 pmol). A la par de la curva de dosage se añadieron tres controles experimentales distintos: 1) Control del medio (COM), es decir, gónadas en cultivo sin que se sometieran al tratamiento con siRNAs, 2) Control con Lipofectamina (CL), es decir, gónadas en cultivo a las que únicamente se le añadió Lipofectamina sin los siRNAs y 3) Control de secuencia (CS), es decir, gónadas que se transfectaron con la secuencia control diseñada. En esta ocasión las gónadas se incubaron a 26 °C por 24 y 72 h. Una hora antes de terminar el tiempo de transfección se sustituyó la mezcla de transfección por una solución de BrdU diluida 1:500 en medio Opti-MEM sin suplementar, esto como un marcaje de proliferación celular. Las gónadas se preservaron en PAF 4% para análisis inmunohistoquímicos y en RNA later para qPCR. Adicionalmente se preservaron gónadas recién disecadas (sin que pasaran por el cultivo) de embriones incubados a TPM en E23 además de embriones incubados a TPH en E29, los cuales se utilizaron como controles de machos y hembras con presencia y ausencia de Sox9, respectivamente.

4.3.2.3. Confirmación del bloqueo post-transcripcional por inmunofluorescencia Se realizaron cortes por congelación de las gónadas transfectadas así como de los controles. Estos cortes se utilizaron para realizar una inmunofluorescencia doble con un anticuerpo anti-Sox9 específico de L. olivacea y un anticuerpo anti-Citoqueratina (Cq) de humano para marcar células epiteliales. En la figura 44 se muestra la inmunofluorescencia de Sox9 y Cq de los controles de hembra E29 (Fig. 44A y B) y macho E23 (Fig. 44D y E), donde se puede ver que las células pre-Sertoli que forman los cordones medulares en el macho, son positivas a Sox9 mientras que las células del epitelio superficial son negativas a esta proteína. Por otro lado, en la hembra, la proteína Sox9 prácticamente desaparece en la zona medular de la gónada, mientras que el epitelio superficial permanece negativo. Adicionalmente las imágenes fueron analizadas con el software ImageJ que permite graficar la intensidad del fluorocromo deseado, en este caso el que corresponde a Sox9, que da una señal roja. De esta forma se puede observar que en la gráfica correspondiente al corte de gónada de hembra (Fig. 44C), la señal de Sox9 es negativa, mientras que en la gráfica de la gónada de macho (Fig. 44F), la señal es positiva e intensa, notándose una clara diferencia entre ambos.

En la figura 45 se muestran los cortes de las gónadas del primer experimento donde el tiempo de transfección fue de 24 h. En las imágenes se muestra la inmunofluorescencia doble de Sox9-Cq, en donde se puede ver la señal positiva de Sox9 marcada con rojo y la de Cq marcada con verde, la cual es específica de células epiteliales; mientras que la señal azul muestra los núcleos celulares. En las imágenes correspondientes a los controles se puede observar una presencia de Sox9 muy intensa como se esperaba, tanto en COM, como en CL y CS (Fig. 45A, B y C, respectivamente), lo que sugiere que ni el cultivo, ni la Lipofectamina, ni tampoco la secuencia control están afectando la expresión de Sox9. Por otro lado, en las gónadas tratadas con los siRNAS se puede observar un efecto dosis-dependiente tanto en la intensidad de Sox9 como en el número de células que lo expresan, sin embargo, este efecto no es muy evidente hasta la concentración de 300 y 600 pmol (Fig. 45E y F) ya que en la concentración de 100 pmol (Fig. 45D) la señal de Sox9 es muy similar a los controles. Esto se puede apreciar mejor en las gráficas obtenidas con el programa ImageJ, donde se pueden observar los controles con la señal de Sox9 muy intensa (Fig. 46A, B y C) al igual que en la primer

concentración del siRNA (100 pmol, Fig. 46D). Sin embargo, a 300 y 600 pmol (Fig. 46E y F) la señal de Sox9 es menos intensa en comparación con los controles, disminuyendo también el número de células que lo expresan, sobre todo con la dosis de 600 pmol. La inmunofluroescencia con BrdU se muestra en la figura 47. En estas imágenes se puede observar como las células de las gónadas en todos los tratamientos y en los controles presentaban proliferación celular. La bromodesoxiuridina (BrdU) es un nucleótido sintético análogo a la timidina, esto permite una substitución casi total de los nucleótidos de timidina en las células en fase de síntesis. Esto sugiere que la integridad de las gónadas no fue severamente afectada en el cultivo y que la mayoría de las células continuaba en proliferación.

En el segundo experimento donde las gónadas permanecieron 72 h con la mezcla de transfección el efecto del siRNA fue aún más notorio. En la figura 48, se muestran los resultados de la inmunofluorescencia de Sox9-Cq en las gónadas después de 72 h de haber sido transfectadas. En estas imágenes se puede ver en los controles COM, CL y CS una señal de Sox9 intensa en la mayoría de las células pre-Sertoli que forman los cordones medulares mientras que el epitelio superficial aparece negativo (Fig. 48 A, B y C, respectivamente). Aún más, el efecto dosis-dependiente en la señal de Sox9 es muy notorio en los tratamientos con el siRNA. En la concentración de 100 pmol (Fig. 48D), la señal de Sox9 disminuye tanto en intensidad como en células que lo expresan. Esta disminución en intensidad de señal es aún más notorio en la concentración de 300 y 600 pmol (Fig. 48E y F, respectivamente). Estos resultados se pueden corroborar perfectamente con las gráficas obtenidas con el programa ImageJ (Fig. 49). Las gráficas que representan los controles, aparecen con una señal de Sox9 intensa y similar entre las tres (Fig. 49A, B y C); mientras que el efecto del siRNA dependiente de la dosis es aún más notorio en estas imágenes, ya que la disminución en la intensidad de la señal positiva de Sox9 comienza a notarse desde la primera dosis (100 pmol, Fig. 49D), donde la intensidad de la señal de Sox9 es menor en este tratamiento comparado con los controles. Aún más, en las dosis de 300 y 600 pmol (Fig. 49E y F), tanto la señal de Sox9 como el número de células que lo expresan disminuyen de manera importante en comparación con los controles, donde en la dosis más alta, la señal prácticamente desaparece. En la figura 50, se presenta la inmunofluorescencia con BrdU donde se

puede observar que un importante número de células se encuentran en fase de síntesis y han incorporado la BrdU durante el proceso de división celular, lo cual es un indicativo de la integridad de las gónadas en todos los tratamientos durante el cultivo por 72 h. Estos resultados si bien no son cuantitativos, si sugieren la posibilidad de haber logrado el bloqueo post-transcripcional de Sox9 en las gónadas en cultivo, ya que es evidente la diferencia que se encontró en la señal de Sox9 en las gónadas tratadas en comparación con los controles, sobre todo a las 72 h de transfección. Además, sugieren que este posible silenciamiento fue debido a un efecto específico de los siRNAs transfectados, ya que no se observa una disminución aparente en la señal de Sox9 en los controles del medio (COM) ni en los controles de lipofectamina (CL), y aún más, tampoco se aprecia una disminución de la señal con los controles de la secuencia (CS) lo que nos permite inferir una especificidad de los siRNAs diseñados. El hecho de que la BrdU haya sido incorporada por un número importante de células gonadales en todos los tratamientos tanto a 24 como a 72 h, nos indica que si bien las condiciones in vitro son muy diferentes a las condiciones in vivo, es posible mantener una integridad en las gónadas cultivadas sin que haya una evidente muerte celular.

En estudios previos, Davies y colaboradores (2004) adaptaron por primera vez la técnica del RNAi a un sistema tri-dimensional de cultivo de riñones de ratón. Usando siRNAs y transfección con oligofectamina ellos lograron reprimir la expresión del gen Wt1 aproximadamente un 80% en diferentes estadios de desarrollo del riñón y concluyeron que Wt1 no solo es necesario para la formación del riñón en estadios tempranos, sino que también es necesario para la diferenciación de los nefrones en estadios posteriores ya que ellos pudieron observar no solo la disminución de los niveles de la proteína por inmunofluorescencia sino que también pudieron observar un efecto fenotípico del silenciamiento.

Desafortunadamente, este ensayo no nos permitió observar un efecto morfológico del silenciamiento de Sox9, ya que las gónadas permanecieron en cultivo muy poco tiempo. Esto se debió a que como primer paso teníamos que asegurar un protocolo para silenciar post-transcripcionalmente el gen de Sox9 y después diseñar un ensayo donde las gónadas permanecieran más tiempo en cultivo y permitirles diferenciarse y quizá de esta manera

poder observar un efecto morfológico del bloqueo de Sox9, sin embargo esto no fue posible debido a la falta de organismos. No obstante, Moreno-Mendoza y colaboradores (2001) demostraron que es posible mantener las gónadas en cultivo hasta por 15 días sin reportar muerte celular o contaminación en el cultivo y no sólo eso, ellos además demostraron que Sox9 es capaz de responder a la temperatura en el cultivo, aumentando o reprimiendo su expresión cuando las gónadas fueron cambiadas de TPH a TPM y viceversa. Esto sugiere que los procesos moleculares que intervienen en la regulación de Sox9 in vivo permanecen activos in vitro, ya que es posible manipular la expresión de Sox9 por medio de la temperatura, por lo tanto, es muy factible la posibilidad de encontrar algún efecto funcional como respuesta al silenciamiento de Sox9 in vitro ya sea a nivel fenotípico o molecular.

Figura 44. Doble inmunofluorescencia de Sox9 y Citoqueratina (Cq) en gónadas de embriones en estadio (E) 29 incubados a

TPH (A y B) y de embriones en E23 incubados a TPM ( D y E). La señal roja indica la detección de la proteína de Sox9 mientras que la señal verde indica la presencia de Cq en células epiteliales; los núcleos celulares están marcados con azul. C y F) Graficas obtenidas con el programa Image J donde se grafica la intensidad de la señal correspondiente a Sox9 tanto a TPH (C) como a TPM (F).

Figura 45. Confirmación del bloqueo post-transcripcional de Sox9 por inmunofluorescencia doble de Sox9 y Citoqueratina

(Cq) en el experimento a 24 h. En las imágenes se muestran los controles experimentales: control del medio (A), control de Lipofectamina (B) y control de secuencia (C); también se muestran las imágenes de las gónadas tratadas con la curva de dosage de siRNA: 100 pmol (D), 300 pmol (E) y 600 pmol (F). La señal roja indica la detección de la proteína de Sox9 mientras que la señal verde indica la presencia de Cq en células epiteliales; los núcleos celulares están marcados con azul.

Figura 46. Análisis de las imágenes de la inmunofluorescencia doble de Sox9 y Citoqueratina del bloqueo post-

transcripcional a 24 h por medio del programa ImageJ. En las imágenes se muestran las gráficas de la intensidad de la señal correspondiente a Sox9 de los controles experimentales: control del medio (A), control de Lipofectamina (B) y control de secuencia (C); también se muestran las gráficas de las gónadas tratadas con la curva de dosage de siRNA: 100 pmol (D), 300 pmol (E) y 600 pmol (F).

Figura 47. Inmunofluorescencia con BrdU del bloqueo post-transcripcional de Sox9 en el experimento a 24 h. En las

imágenes se muestran los controles experimentales: control del medio (A), control de Lipofectamina (B) y control de secuencia (C); también se muestran las imágenes de las gónadas tratadas con la curva de dosage de siRNA: 100 pmol (D), 300 pmol (E) y 600 pmol (F). La señal verde indica la detección de BrdU mientras que los núcleos celulares están marcados con azul.

Figura 48. Confirmación del bloqueo post-transcripcional de Sox9 por inmunofluorescencia doble de Sox9 y Citoqueratina

(Cq) en el experimento a 72 h. En las imágenes se muestran los controles experimentales: control del medio (A), control de Lipofectamina (B) y control de secuencia (C); también se muestran las imágenes de las gónadas tratadas con la curva de dosage de siRNA: 100 pmol (D), 300 pmol (E) y 600 pmol (F). La señal roja indica la detección de la proteína de Sox9 mientras que la señal verde indica la presencia de Cq en células epiteliales; los núcleos celulares están marcados con azul.

Figura 49. Análisis de las imágenes de la inmunofluorescencia doble de Sox9 y Citoqueratina del bloqueo post-

transcripcional a 72 h por medio del programa ImageJ. En las imágenes se muestran las gráficas de la intensidad de la señal correspondiente a Sox9 de los controles experimentales: control del medio (A), control de Lipofectamina (B) y control de secuencia (C); también se muestran las gráficas de las gónadas tratadas con la curva de dosage de siRNA: 100 pmol (D), 300 pmol (E) y 600 pmol (F).

Figura 50. Inmunofluorescencia con BrdU del bloqueo post-transcripcional de Sox9 en el experimento a 72 h. En las

imágenes se muestran los controles experimentales: control del medio (A), control de Lipofectamina (B) y control de secuencia (C); también se muestran las imágenes de las gónadas tratadas con la curva de dosage de siRNA: 100 pmol (D), 300 pmol (E) y 600 pmol (F). La señal verde indica la detección de BrdU mientras que los núcleos celulares están marcados con azul.

4.3.2.4. Confirmación del bloqueo post-transcripcional por PCR en tiempo real

Adicionalmente se llevaron a cabo análisis de PCR en tiempo real para cuantificar los niveles de mRNA de Sox9 así como de Amh, lo que nos permitió analizar la respuesta de este último ante el silenciamiento de Sox9, ya que se ha sugerido que Sox9 puede regular la expresión de Amh de manera directa o indirecta en L. olivacea, como se ha reportado en mamíferos (Merchant-Larios et al., 2010). De las gónadas cultivadas se extrajo RNA total con ayuda de un kit de extracción de RNA (Promega) y se sintetizó cDNA en presencia de primers aleatorios. Se diseñaron primers específicos a partir de una secuencia parcial de Amh de L. olivacea proporcionada por la Dra. Verónica Díaz- Hernández, los primers diseñados se muestran en la tabla 15, mientras que los primers utilizados para Sox9 se muestran en la tabla 10. Estos análisis se realizaron únicamente en las gónadas transfectadas por 72 h ya que en este experimento fue donde se encontró por inmunofluorescencia un silenciamiento de Sox9 más evidente. Para la cuantificación de la expresión génica se utilizó Eva Green (Biorad) para la detección de los amplicones. Para calcular los niveles de expresión se utilizó el método de CT comparativo siguiendo la misma metodología descrita anteriormente para los genes Hox y Sox9, sólo que en esta ocasión únicamente se pudo utilizar como control interno el gen β-actina de L. olivacea. Se analizaron dos gónadas por tratamiento las cuales se corrieron por duplicado, sin embargo el tamaño de muestra (n=2) no permitió la realización de análisis estadísticos, sin embargo si nos dio una idea de la tendencia que presentaban los niveles de expresión relativa encontrados para ambos genes, la cual fue una tendencia evidente y consistente a lo que se encontró por inmunofluorescencia.

Tabla 15. Primers diseñados para PCR cuantitativo a partir de una secuencia parcial de

Amh de L. olivacea

Oligo Secuencia

Amh-qPCR-F 5’-AGA AGT TCC AGG CTG TCA TCC A- 3’ Amh-qPCR-R 5’-ACC TTC CTC TTC TCC TGC CAG T- 3’

En la figura 51 se muestra la expresión relativa del gen Sox9 de todos los tratamientos analizados que se mantuvieron en cultivo, así como de los controles de macho en E23 y de hembra en E29. Como se esperaba, los niveles de expresión de las hembras ya

diferenciadas es mucho menor que los niveles de expresión del macho en el E23 al ser Sox9 un gen determinante testicular. Esto es consistente a lo encontrado en este mismo trabajo (capítulo III) y con lo reportado anteriormente por Moreno-Mendoza et al., (1999) y por Torres-Maldonado et al., (2001, 2002). Sin embargo, los niveles de expresión encontrados en los controles de las gónadas en cultivo disminuyeron considerablemente, ya que se esperaba que estos fueran iguales o muy cercanos a los del macho en E23. Esto sugiere que quizá la integridad de las gónadas sí se vio afectada, pues esta disminución en los niveles de expresión de Sox9 puede deberse quizá a muerte celular. Sin embargo, el hecho de que los tres controles presenten diferencias en los niveles de expresión, en donde por ejemplo, CS presente valores muy cercanos a los de machos, sugiere una posible variación a nivel individual, que quizá debido al tamaño de muestra tan bajo no se pudo amortiguar. Esto resalta la importancia de analizar un número mayor de individuos por tratamiento que no sólo permita obtener la dispersión individual, sino que además nos permita evaluar estadísticamente las diferencias encontradas. A pesar de esto, en los niveles de expresión de Sox9 de las gónadas tratadas con el siRNA y consistente con los resultados encontrados por inmunofluorescencia, se puede observar un efecto dosis dependiente, en donde ya en la dosis más baja (100 pmol) se nota una disminución en el transcrito de Sox9, sin embargo esta disminución es más evidente en la dosis de 300 y 600 pmol, en donde los niveles de expresión son muy cercanos a cero en la dosis más alta, muy similares a los encontrados en las hembras en E29.

Por otro lado, en la figura 52 se muestran los resultados encontrados para el gen de Amh. En estos, similar a lo que se encontró para Sox9, los niveles de expresión en los controles de macho E23 y hembra E29 resultaron como se esperaba, es decir, los niveles de expresión son mucho menores en las hembras diferenciadas con valores muy cercanos a cero, que los encontrados en los machos, lo cual es consistente con un rol del gen Amh en la ruta testicular en organismos con TSD (Western & Sinclair, 2001; Shoemaker et al., 2007a y b; Merchant-Larios et al., 2010). Sin embargo, a diferencia de lo sucedido con Sox9, los niveles de expresión de los controles de las gónadas en cultivo (CL y CS) fueron muy cercanos a los niveles de expresión de los machos, por lo que aparentemente no se notó el efecto del cultivo en la expresión de este gen, con excepción

de COM cuyos valores de expresión son evidentemente menores al resto de los controles. Por otro lado, en las gónadas tratadas con el siRNA se encontró un patrón de expresión similar al encontrado para Sox9, en donde los valores de expresión de Amh comienzan a disminuir en la dosis de siRNA más baja (100 pmol), siendo esta disminución mucho más evidente en dosis más altas (300 y 600 pmol) sin que se viera una diferencia aparente entre estas dos últimas. Estos resultados son muy interesantes, ya que como se puede observar, el patrón de expresión encontrado para Amh es muy similar al encontrado para Sox9 en respuesta a los siRNAs, lo que permite suponer que Amh disminuye sus niveles de expresión en respuesta al silenciamiento de Sox9. Esta expresión coordinada nos pudiera sugerir que a diferencia de lo encontrado en otras especies como pollo o el lagarto Americano (Oreal et al., 1998; Western & Sinclair, 2001, respectivamente), donde la expresión de Amh precede la expresión de Sox9; en L. olivacea, es posible que Sox9 pudiera regular de manera directa o indirecta la expresión de Amh.

Consistente con estos resultados, en T. scripta se ha reportado que la expresión de Sox9 precede la expresión de Amh durante el PST en gónadas de embriones incubados a TPM (Shoemaker et al., 2007a y b); además, Merchant-Larios y colaboradores (2010), mencionan que en la tortuga golfina, la detección de la proteína Amh también se