Machine Learning Techniques related to Classification

Para analizar los sitios de expresión de los genes HoxD11 y HoxA13, se utilizaron gónadas y mesonefros de L. olivacea incubados a TPH y TPM. Estos fueron analizados durante el PST y el PDS por medio de hibridación in situ con las sondas “sense” o “antisense” generadas para cada gen.

2.3.4.1. Hibridación in situ HoxD11

En la figura 22 se muestra la hibridación in situ con la sonda “antisense” del gen HoxD11 en cortes transversales de gónadas de embriones de L. olivacea incubados a TPH. En la figura 22A y C, se observa que la expresión de HoxD11 es baja durante el E24, localizándose en las células que forman los cordones medulares en la gónada indiferenciada. Por otro lado, durante el E27, HoxD11 muestra un decremento en los niveles de expresión y de manera interesante, HoxD11 cambia su sitio de expresión, localizándose durante este estadio, en las células del estroma; mientras que las células presuntamente pre-granulosas, muestran una señal negativa (Fig. 22B y D). Esta disminución en la expresión de HoxD11 fue consistente con los resultados obtenidos en el qPCR, aunque este decremento no fue estadísticamente significativo, la tendencia a disminuir es clara y se puede corroborar con la hibridación in situ. Si bien es cierto que los niveles de expresión que mostró HoxD11 tanto por qPCR como por hibridación in situ son bajos con respecto a los obtenidos para Sox9 (ver capitulo III), no se puede descartar la posibilidad de que este gen esté desempeñando alguna función específica en la gónada de hembra al inicio de su diferenciación, sobre todo por el patrón de expresión espacial diferencial que se encontró entre estadios, en donde durante el periodo sensible a la temperatura, HoxD11 se está expresando en las células medulares y una vez que la gónada inicia su diferenciación, HoxD11 cambia su sitio de expresión a las células estromáticas, dirigiendo tal vez, por medio de algún mecanismo parácrino, la diferenciación de las células pre-granulosas o bien la proliferación de las células del córtex, cambios que indican que la gónada ha tomado la ruta de hembra y comienza entonces su diferenciación.

En la figura 23, se muestra la hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxD11 en gónadas incubadas a TPM. Durante el estadio 23, perteneciente al PST (Fig. 23A y C),

HoxD11 presenta una expresión muy baja, casi imperceptible por la hibridación in situ, localizándose en células del tejido estromático, mientras que durante el estadio 27 (Fig. 23B y D), al inicio de la diferenciación testicular, la expresión de HoxD11 pareciera aumentar ligeramente, sin embargo su localización no cambia, encontrándose también en el tejido estromático. De acuerdo con los resultados obtenidos por PCR cuantitativo, este ligero incremento en la expresión de HoxD11 no es significativo. Los bajos niveles de expresión génica que presenta HoxD11 dificultan un poco la inferencia de una posible función durante la determinación y diferenciación de la gónada a TPM. Es probable que HoxD11 no esté desempeñando un papel importante en la gónada masculina, contrario a lo observado a TPH, donde HoxD11 a pesar de los bajos niveles de expresión, éste presenta una expresión diferencial tanto espacial como cuantitativa (aunque este decremento no fue estadísticamente significativo, la tendencia a disminuir es clara). Esto nos lleva a pensar en la probabilidad de que un cambio en los niveles de expresión de HoxD11 así como un cambio en el sitio de expresión de este gen influya en el inicio de la diferenciación ovárica, sin tener aparentemente algún papel importante en la diferenciación testicular.

A manera de control negativo, se realizó la hibridación in situ con la sonda “sense” de HoxD11 en gónada a TPH mostrando una señal negativa tanto en el estadio 24 (Fig. 22E) como en el estadio 27 (Fig. 22F), sucediendo exactamente lo mismo a TPM durante el E23 (Fig. 23E) y durante el E27 (Fig. 23F).

En el mesonefros a TPH, la hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxD11 mostró una alta expresión en las células de los túbulos mesonéfricos durante el E24 perteneciente al PST (Fig. 24A), mostrando un notable decremento durante el E27, donde la expresión es prácticamente indetectable por hibridación in situ (Fig. 24B). Sin embargo con qPCR, al ser una técnica más sensible, podemos constatar que la expresión no desaparece por completo, ya que por medio de esta técnica sí se detectó expresión de HoxD11 durante este estadio, aunque ésta presenta valores de expresión cercanos al cero (Fig. 24B). Cabe mencionar que la expresión de HoxD11 en mesonefros en el E27 se concentró en los ductos tanto mesonéfrico como paramesonéfrico (ver abajo), esto podría explicar por qué en el qPCR si se haya detectado expresión génica, ya que el tejido mesonéfrico incluía ambos ductos. El notable decremento en la expresión de

HoxD11 en mesonefros, podría indicar que la represión de este gen probablemente se requiera para iniciar su regresión una vez que la cresta urogenital ha tomado ya la ruta de hembra.

Por el contrario en el mesonefros a TPM, HoxD11 mostró niveles de expresión bajos durante el E23 (Fig. 25A) muy similares a los que se observan durante el E27 (Fig. 25B). Estos resultados coinciden con los obtenidos por PCR cuantitativo, donde se mostró una expresión constante, sin que hubiera un aumento o disminución significativa entre los estadios, lo cual nos pudiera indicar que a diferencia del mesonefros de hembra, HoxD11 posiblemente no desempeña algún papel importante en la diferenciación de este tejido en el macho. La hibridación in situ con la sonda “sense” de HoxD11 en mesonefros mostró señal negativa tanto a TPH durante los estadios 24 (Fig. 24C) y 27 (Fig. 24D) como a TPM en los estadios 23 y 27 (Fig. 25C y 25D, respectivamente), corroborando la hibridación específica de la sonda “antisense”.

En la figura 26 se muestra la hibridación in situ realizada con la sonda “antisense” de HoxD11 en los ductos genitales tanto a TPH (Fig. 26A) como a TPM (Fig. 26B) durante el estadio 27. En ésta, se observan niveles de expresión relativamente altos de este gen, sin embargo, no muestra algún patrón de expresión diferencial entre el ducto de Wolffian (DW) y el ducto de Müller (DM) en ninguna de las dos temperaturas. Es muy probable que HoxD11 no esté participando de manera importante en la diferenciación de estas estructuras hacia la ruta de hembra o de macho, ya que no mostró ningún patrón de expresión diferencial, ni cuantitativo ni espacial entre las dos temperaturas. Sin embargo, de acuerdo a sus niveles de expresión, es evidente que HoxD11 está participando en el desarrollo de los ductos genitales en ambos sexos, pero no está interviniendo en el dimorfismo sexual como tal.

De manera similar a lo sucedido en gónada y mesonefros, la sonda “sense” de HoxD11 mostró señal negativa en los ductos genitales tanto a TPH (Fig. 26C) como a TPM (Fig. 26D) durante el E27.

De acuerdo al patrón de expresión encontrado para HoxD11, es muy probable que este gen este desempeñando un papel más importante en la ruta de hembra, que fue donde se encontró un patrón de expresión diferencial entre los estadios. Aun a pesar de que los

valores de expresión son bajos, las funciones que pueda estar desempeñando este gen pudieran ser dosis-dependiente, por lo que bajas dosis de HoxD11 sean suficientes para quizá regular algunos genes que estén involucrados en la iniciación de la diferenciación ovárica por lo que la represión de este gen durante el E27 sea necesaria para iniciar procesos tales como la proliferación de las células del córtex o la fragmentación de los cordones medulares. Es importante recordar que los genes Hox funcionan de manera combinatoria con genes parálogos y es la combinación de sus funciones lo que define las estructuras en las cuales se expresan. Por otro lado, la expresión constante de HoxD11 en gónadas y mesonefros a TPM, sin que se presente ningún cambio en los niveles ni en el sitio de expresión, sugiere que HoxD11 podría estar regulando funciones basales tanto en gónada como en mesonefros, así como también en los ductos genitales.

El hecho de que HoxD11 presentara los niveles más bajos de expresión, pudiera indicar que este gen esté desempeñando algún papel más importante en estadios embrionarios más tempranos, es decir, anteriores a los periodos sensible a la temperatura y de diferenciación sexual, participando quizá en procesos como la morfogénesis del tracto urogenital durante el periodo indeterminado como es el caso de los ratones, ya que se sabe que ratones nulos a HoxD13 no presentan desarrollo del tubérculo genital ni de la parte caudal del intestino posterior así como de los ductos mesonéfricos (Warot et al., 1997). Esto podría indicar, quizá, que genes pertenecientes al cluster D, como por ejemplo HoxD11 participen de manera más activa en la formación del tracto urogenital durante el periodo indeterminado, por lo que durante este estadio podríamos esperar niveles de expresión más altos.

Es bien sabido que los genes Hox actúan como reguladores de la morfogénesis en el embrión en desarrollo desempeñando un papel esencial al promover la proliferación y diferenciación celular así como la apoptosis (Taylor et al., 1998, 1999). Si bien no existe ningún estudio funcional que demuestre que los genes Hox participan durante la gonadogénesis (ver Svingen and Koopman, 2006), es posible que estos genes estén involucrados en el desarrollo del tracto reproductivo, ya que se ha reportado una alta expresión del gen HoxD9 en células del primordio gonadal de ratones, lo que sugiere que este gen pueda participar induciendo la especificación de las células que darán origen a la gónada. Además, la expresión de HoxD9 es persistente y continúa durante el

desarrollo gonadal hasta estadios en los cuales la diferenciación sexual es claramente visible (Dollé and Duboule, 1989); resultados similares se han reportado para HoxD10 (Dollé et al., 1991). Por todo esto es probable que genes del cluster HoxD como HoxD11 participen en la determinación y/o diferenciación del tracto reproductivo de tortugas marinas, pero para corroborarlo haría falta un estudio funcional. Sin embargo hay que destacar que este es el primer reporte de expresión de genes Hox en el tracto reproductor en un organismo que presenta TSD.

Figura 22. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxD11 en cortes transversales de gónadas de L. olivacea

incubadas a TPH (33ºC) (A, B, C, D). Durante el estadio (E) 24 (A, C), HoxD11 se expresa en células medulares (flechas), sin embargo para el E27 (B, D), los niveles de expresión disminuyen y esta se localiza en tejido estromático (cabezas de flecha). La hibridación in situ con la sonda “sense” (E, F), mostró una señal negativa tanto en el E24 (E) como en el E27 (F). Barra de escala: 50 µm (A, B, E, F) y 25 µm (C, D).

Figura 23. Hibridación in situ de HoxD11 en cortes transversales de gónadas de L. olivacea incubadas a TPM (26ºC) con la

sonda “antisense” (A, B, C, D). Durante el estadio (E) 23 (A, C), HoxD11 muestra bajos niveles de expresión localizada en tejido estromático (flechas), sin embargo para el E27 (B, D), la expresión incrementa notoriamente localizándose también en tejido estromático. La hibridación in situ con la sonda “sense” (E, F), mostró una señal negativa tanto en el E23 (E) como en el E27 (F). Barra de escala: 50 µm (A, B, E, F) y 25 µm (C, D).

Figura 24. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxD11 en cortes transversales de mesonefros de L. olivacea

incubados a TPH (33ºC) (A, B). Durante el estadio (E) 24 (A), HoxD11 muestra niveles de expresión relativamente altos, sin embargo para el E27 (B), la expresión disminuye notoriamente a niveles casi imperceptibles. La hibridación in situ con la sonda “sense” (C, D), mostró una señal negativa tanto en el E24 (C) como en el E27 (D). Barra de escala = 50 µm.

Figura 25. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxD11 en cortes transversales de mesonefros de L. olivacea

incubados a TPM (26ºC) (A, B). HoxD11 presenta bajos niveles de expresión apenas detectables por la hibridación in situ (flechas) tanto en el estadio (E) 23 (A) como en el E27 (B). La hibridación in situ con la sonda “sense” (C, D), mostró una señal negativa tanto en el E23 (C) como en el E27 (D). Barra de escala = 50 µm.

Figura 26. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxD11 en ductos genitales de L. olivacea, incubados a TPH (A) y

a TPM (B) durante el estadio 27. En ambas temperaturas, HoxD11 mostró niveles de expresión relativamente altos tanto en el ducto de Wolffian (DW) como en el ducto Mülleriano (DM). La hibridación in situ con la sonda “sense” (C, D), mostró una señal negativa tanto a TPH (C) como a TPM (D). Barra de escala = 50 µm

2.3.4.2. Hibridación in situ HoxA13

En la hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxA13 en gónadas incubadas a TPH se puede oservar que durante el estadio 24 (Fig. 27A y C), perteneciente al periodo sensible a la temperatura, HoxA13 presenta niveles de expresión mayores que los que se observan durante el E27 (Fig. 27B y D) mostrando un notable decremento, sin embargo, durante ambos estadios la expresión de HoxA13 se localiza en tejido estromático; por lo que tanto las células que forman los cordones medulares en la gónada indiferenciada (E24) como las células pre-granulosas localizadas en la región medular (E27), muestran una señal negativa. Estos resultados son consistentes a los obtenidos con PCR cuantitativo donde se encontró un decremento significativo (99%) en los niveles de expresión de HoxA13 en el E27 con respecto al E24 (Fig. 27A). Este decremento en la expresión de HoxA13 nos hace pensar que este gen no está participando de manera directa en la iniciación de la diferenciación ovárica, es decir, quizá la represión de HoxA13 sea necesaria para iniciar ya sea, la fragmentación de los cordones medulares o la proliferación de las células del córtex.

Por otro lado, en gónadas a TPM durante el E23 (Fig. 28A y C), la expresión de HoxA13 es prácticamente nula, ya que es indetectable por la hibridación in situ, mientras que para el E27 (Fig. 28B y D) los valores de expresión aumentan, siendo el tejido estromático el sitio de expresión, mientras que las células pre-Sertoli muestran una señal negativa. Al comparar estos resultados con los obtenidos por qPCR, podemos observar que durante el E23, el qPCR mostró alta variabilidad en los datos (Fig. 28A), por lo que la misma variabilidad ocurre con los organismos analizados por hibridación in situ. Sin embargo, los niveles de expresión son muy bajos por lo que la diferencia que hay entre los estadios no es significativa. Esto nos lleva a pensar que probablemente HoxA13 no este desempeñando un papel importante en los procesos de determinación y diferenciación testicular en L. olivacea.

De acuerdo a los patrones de expresión encontrados a TPM y TPH, tanto por hibridación in situ como por qPCR, es probable que HoxA13 juegue un papel más importante en la ruta de hembra, ya que fue en ésta donde se encontró un patrón de expresión diferencial cuantitativo significativo entre los dos estadios analizados, sugiriendo que una represión

de este gen sin que haya un cambio en el sitio de expresión, es necesaria para la diferenciación ovárica. Sería interesante además, analizar el resto de los estadios pertenecientes al PST, para investigar el momento en que se presenta la regulación negativa de este gen, lo que nos permitiría sugerir que este gen podría estar participando en la determinación de la gónada hacia la ruta de hembra. Por el contrario, a TPM los niveles de expresión no cambian en el tiempo, además de presentar valores de expresión menores con respeto a los observados a TPH, lo que sugiere que HoxA13 participe quizá, en funciones basales de la gónada de macho tanto en el periodo sensible a la temperatura como en el periodo de diferenciación sexual.

La hibridación in situ que se llevó a cabo con las sonda “sense” de HoxA13 en gónadas a TPH (Fig. 27), permite observar que tanto en el E24 (Fig. 27E) como en el E27 (Fig. 27F), la señal fue negativa. Lo mismo sucedió en las gónadas a TPM en donde se observa una señal negativa en ambas temperaturas (Fig. 28E y F, E23 y E27 respectivamente).

El patrón de expresión de HoxA13 en mesonefros fue muy similar al encontrado en la gónada tanto a TPM como a TPH. La hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxA13 en mesonefros a TPH (Fig. 29), muestra que durante el E24 (Fig. 29A), la expresión de HoxA13 se observa en las células de los túbulos mesonéfricos presentando niveles de expresión mayores a los que se presentan durante el E27 (Fig. 29B), lo que representa un decremento en los niveles de expresión de este gen una vez que el periodo de diferenciación sexual comienza. Estos resultados son consistentes con qPCR el cual mostró un patrón de expresión diferencial, encontrando un decremento importante del 94% en el E27 con respecto al E24 (Fig. 29B). Similar a lo sucedido en la gónada, los resultados tanto de PCR cuantitativo como los de la hibridación in situ, sugieren que probablemente una represión de HoxA13 se requiera para la regresión del mesonefros. Por otro lado, a TPM (Fig. 30), los niveles de expresión no presentan cambios significativos a lo largo del tiempo, presentando niveles de expresión muy bajos, prácticamente indetectables por la hibridación in situ tanto en el E23 (Fig. 30A) como durante el E27 (Fig. 30B). Esto sugiere que HoxA13 no juega un papel importante en la diferenciación del mesonefros en la ruta de macho. La hibridación in situ con la sonda “sense” de HoxA13 en mesonefros a TPH, mostró en ambos estadios analizados una

señal negativa (Fig. 29C y D, E24 y E27 respectivamente). De manera similar, en la figura 30C y D se muestra la hibridación in situ con la sonda “sense” de HoxA13 a TPM durante el E23 y E27 respectivamente, mostrando en ambos una señal negativa.

Figura 27. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxA13 en cortes transversales de gónadas de L. olivacea

incubadas a TPH (33ºC) (A, B, C, D). Durante el estadio (E) 24 (A, C), la expresión de HoxA13 se localiza en tejido estromático, presentando altos niveles de expresión con respecto a los que se observan durante el E27 (B, D), sin embargo el sitio de expresión permanece en tejido estromático (flechas). La hibridación in situ con la sonda “sense” (E, F), mostró una señal negativa tanto en el estadio 24 (E) como en el E27 (F). Barra de escala: 50 µm (A, B, E, F). 25 µm (C, D).

Figura 28. Hibridación in situ de HoxA13 en cortes transversales de gónadas de L. olivacea incubadas a TPM (26ºC) con la

sonda “antisense” (A, B, C, D). Durante el estadio (E) 23 (A, C), los niveles de expresión de HoxA13 son indetectables, sin embargo para el E27 (B, D), la expresión incrementa localizándose en tejido estromático (flechas). La hibridación in situ con la sonda “sense” (E, F), mostró una señal negativa tanto en el E23 (E) como en el E27 (F). Barra de escala: 50 µm (A, B, E, F). 25 µm (C, D).

Figura 29. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxA13 en cortes transversales de mesonefros de L. olivacea

incubados a TPH (33ºC) (A, B). Durante el estadio (E) 24 (A), HoxA13 muestra altos niveles de expresión, sin embargo para el E27 (B), la expresión disminuye notoriamente a niveles casi imperceptibles. La hibridación in situ con la sonda “sense” (C, D), mostró una señal negativa tanto en el estadio 24 (C) como en el E27 (D). Barra de escala = 50 µm.

Figura 30. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de HoxA13 en cortes transversales de mesonefros de L. olivacea

incubados a TPM (26ºC) (A, B). HoxA13 presenta niveles de expresión prácticamente indetectables por la hibridación in situ tanto en el estadio (E) 23 (A) como en el E27 (B). La hibridación in situ con la sonda “sense” (C, D), mostró una señal negativa tanto en el estadio 23 (C) como en el E27 (D). Barra de escala = 50 µm.

Los patrones de expresión encontrados para el gen HoxD11 y HoxA13, tanto cuantitativos como espaciales, sugieren que estos genes pudieran estar participando en la ruta de hembra, más que en la ruta de macho (Fig. 31) durante la diferenciación sexual. En este sentido, una represión del gen HoxD11 pudiera requerirse para la regresión del mesonefros y quizá para la diferenciación del ovario, ya que, aun a pesar de que esta disminución en los niveles de expresión no fue estadísticamente significativa, si se observó una tendencia clara a disminuir.

Figura 31. Posible participación de los genes Hox durante los procesos de

determianción y diferenciación sexual en el tracto reproductivo de tortuga golfina, L. olivacea con base a los patrones de expresión encontrados en el presente trabajo.

De manera similar, es probable que una represión del gen HoxA13 pudiera ser necesaria para la diferenciación del ovario (Fig. 31), ya sea regulando la proliferación de las células del córtex o la regresión de los cordones medulares. En cuanto a la participación de este gen en mesonefros, es probable que su represión se requiera para la regresión de

este tejido durante la diferenciación sexual, sin embargo ésta no fue estadísticamente significativa aunque sus niveles de expresión si mostraron una tendencia a disminuir. Esta idea es apoyada por el hecho que de los genes Hox han sido implicados en la diferenciación de los ductos genitales (Dollé et al., 1991; Benson et al., 1996; Taylor, 2000) y del tubérculo genital en mamíferos (Warot et al., 1997), en donde genes Hox 5´ tanto del cluster HoxA como HoxD, se expresan de manera colinear. Sin embargo, estos patrones de expresión no son sexo-específicos ya que estos genes presentan niveles de expresión similares en ambos sexos aun a pesar que los ductos genitales ya diferenciados presentan dimorfismo sexual. En este sentido, se ha sugerido que el patrón de