4.4 Research Method and Design
4.4.1 Case Study Method
homocigotos ARID3b
-/-Machos heterocigotos Arid3b+/- se pusieron en cruce con hembras heterocigotas del
mismo tipo con el fin de generar ratones mutantes homocigotos de falta de función para Arid3b. La incapacidad de genotipar estos especimenes por métodos convencionales (PCR o Southern blot) y la posibilidad tanto de genotipar, como de analizar el patrón de expresión de estos embriones, mediante tinción lac-Z, nos llevó a recoger especimenes a diferentes etapas de gestación. A estadio E10.5 se evidenció un severo descenso en los embriones Arid3b-/- recogidos. Además se pudieron observar
evidentes signos de deterioro en embriones supervivientes con este genotipo. Los resultados de este estudio se resumen en la tabla 9.
A B C D +/+ +/- -/- +/+ +/- -/- A B C D +/+ +/- -/- +/+ +/- -/-
Figura 44: Tinciones lac-Z, llevadas a cabo en paralelo, en embriones de estadio E9.5 procedentes de
un cruce Arid3b+/- X Arid3b+/-. De izquierda a derecha se puede distinguir las diferentes intensidades de
señal pertenecientes a especimenes wt, heterocigotos y homocigotos para la mutación insercional. B- D) Misma técnica empleada en fragmentos de cola de embriones Arid3b+/+, Arid3b+/- y Arid3b-/- y
utilizada rutinariamente para genotipar especímenes. Esta técnica resulto muy reproducible y fiable.
Tabla 9: Viabilidad de embriones resultantes de cruces Arid3b+/- x
Arid3b+/-
Estadio -/- +/- +/+ 8.5 34/109 (31%) 45/109 (41%) 30/109 (28%)
9.5 48/164 (29%) 81/164 (49%) 36/164 (22%) 10.5 44/305 (15%) 168/305 (55%) 92/305 (30%)
Nunca se rescataron embriones Arid3b-/- a 11 días y medio después de la fecundación.
Este dato junto con los resultados de la tabla indicaba que la ausencia del gen Arid3b causaba defectos incompatibles con el desarrollo embrionario. A continuación describiremos los fenotipos observados en embriones homocigotos Arid3b-/- (Fig. 45).
1. Los embriones mutantes homocigotos Arid3b-/- evidencian una ausencia de
grandes vasos en el saco vitelino.
En los especimenes Arid3b-/- recogidos a E10.5 se pudo observar un
disminución de vasculatura en el saco vitelino. Analizando estas estructuras en detalle, a estadio E9.5 no se percibieron diferencias en la formación del plexo vascular primitivo, sin embargo, se pudo advertir una ausencia de grandes vasos a estadios posteriores (E10.5). Además, en la deficiente red vascular encontrada se reveló una clara disminución en la cantidad de sangre que contenían. 2. Los embriones mutantes homocigotos Arid3b-/- muestran un retraso evidente
en el crecimiento.
En los embriones Arid3b-/- extraídos a diferentes tiempos se evidenció un
severo retraso en el crecimiento embrionario. Este retraso se comenzó a detectar de manera sutil, en embriones de E9-9.5, haciéndose completamente evidente a E10.5. Los especimenes analizados en esta última fase mostraban un tamaño similar al esperado con un día menos de desarrollo.
3. Los embriones mutantes homocigotos Arid3b-/- presentan defectos en el cierre
del tubo neural.
Un fenotipo observado de manera muy frecuente en los embriones Arid3b-/-
obtenidos a estadio E10.5 fue un tubo neural incorrectamente cerrado y de apariencia ondulante. Aparentemente este defecto resulta más evidente en la región anterior del espécimen. Dicho fenotipo es detectable desde día 9.5 de gestación pero prácticamente imperceptible en estadios anteriores.
4. Los embriones mutantes homocigotos Arid3b-/- presentan malformaciones en la
formación de estructuras craneofaciales.
Con alta frecuencia se recolectaron especimenes Arid3b-/- con malformaciones
en la región rostral. Se detectó una severa hipoplasia de los arcos branquiales acompañada por una disminución en el tamaño de estructuras craneofaciales. 5. Los embriones mutantes homocigotos Arid3b-/- muestran alteraciones en la
formación del corazón y en la organización y disposición de vasos sanguíneos. En embriones Arid3b-/- de E9.5 se pudo observar un dilatación moderada del
pericardio. Un día más tarde en el desarrollo de estos embriones esta dilatación pericárdica incrementó hasta, en algunas ocasiones alcanzar un tamaño similar al del propio espécimen. Se analizó el fenotipo cardiaco a E10.5 bajo la lupa y se observó una interrupción en el proceso del giro del tubo cardiaco. A pesar de estos defectos y una aparente disminución de las células miocárdicas, detectada en secciones de este órgano, el corazón es capaz de latir.
Además, estos mutantes mostraron hemorragias en diferentes puntos del embrión, sugiriendo una posible alteración en la formación de los vasos sanguíneos. En un estudio realizado en mayor detalle se observó que muchos de estos vasos evidenciaban un trazado irregular, desorganizado en
comparación con los individuos control. Además, no se pudo detectar circulación en estos vasos a pesar de la presencia de latido cardiaco.
Figura 45: Fenotipo de los embriones Arid3b-/- a estadio E10.5. A) Defectos en la vasculatura
del saco vitelino. B) Evidente retraso en el crecimiento. C) Anomalías en el cierre del tubo neural. D) Malformaciones en estructuras craneofaciales. E) Alteraciones en el giro del corazón y dilatación del pericardio.
6. Los embriones mutantes homocigotos Arid3b-/- evidencian defectos en la
formación de las extremidades.
En los especimenes recogidos con vida a estadio E10.5, se observó una disminución del tamaño del primordio de la extremidad, presentando anomalías en la morfología de la cresta ectodérmica apical.
Debido a que los embriones mutantes Arid3b-/- presentan un retraso en el
crecimiento, así como cierto estado de deterioro a estadio E10.5, hubiese resultado incorrecto comparar hermanos de camada entre sí ya que podría llevarnos a interpretar erróneamente los defectos en algunos procesos.
Para intentar estandarizar la edad de desarrollo equivalente entre los embriones Arid3b-/- y embriones wt, en especial para la etapa de formación de
la cresta ectodérmica apical, se contaron los somitos formados en embriones Arid3b-/- a estadio E10.5. Se pudo apreciar un descenso significativo en el
número de estos, acorde con el retraso en el desarrollo mostrado por estos especimenes. Los somitos cuantificados (aproximadamente 26-28 pares de
somitos respecto a los 34-36 de sus hermanos de camada) indicaban un retardo de algo menos de un día.
Por ello, se contempló la posibilidad de utilizar embriones con 26-28 pares de somitos como controles equivalentes, sin embargo, el primordio de la extremidad en los embriones Arid3b-/-, pese a presentar un tamaño reducido,
resultó ser una de las estructuras del embrión aparentemente menos perjudicadas por el fenotipo general de estos especimenes. Los primordios de embriones Arid3b-/- de estadio E10.5 mostraban una morfología algo más
madura de lo que correspondía al tamaño obtenido y a los somitos contabilizados. Debido a esto, se realizó un estudio comparativo de las dimensiones relativas de estos primordios frente a sus controles a diferentes etapas embrionarias (n=2 por cada estadio). Se midió la base del primordio y se determinó la distancia entre esta base hasta el punto más distal. La relación obtenida entre ambas medidas fue el parámetro contrastado. De este ensayo se concluyó que los primordios de los embriones Arid3b-/- a estadio 10.5, aunque
mostraban un tamaño absoluto inferior, eran comparables a los observados a estadio E9.5-10 (entre 28 y 30 ps), por lo que los controles seleccionados correspondieron a especimenes en estas etapas de desarrollo (Fig. 46).
Figura 46: Estudio morfométrico del primordio de la extremidad superior en embriones de ratón a
diferentes estadios. Los parámetros medidos son la distancia entre el lado anterior y posterior en la base del primordio y la altura en la parte central de éste. La relación entre ambos parámetros es el valor contrastado. Este valor en los primordios de los embriones Arid3b-/- se corresponde con el observado en
primordios de especimenes wt de 28-30 pares de somitos. A-E) Visiones dorsales de primordios de extremidad superior pertenecientes a embriones recién extraídos.
Se realizaron hibridaciones in situ en embriones Arid3b-/- y en respectivos
controles con Fgf8, revelándose un AER de conformación aberrante, con borde irregular, reducción de tamaño en el eje antero-posterior y extensión en el eje dorso-ventral en los especimenes mutantes (Fig. 47).
Figura 47: Los embriones Arid3b-/- muestran un fenotipo en el primordio de la
extremidad. A, B) Imágenes en campo claro de un primordio de un embrión wt de 28 pares de somitos y de un ejemplar Arid3b -/- en los que se aprecia una clara diferencia en la
morfología de la cresta ectodérmica apical. C y D) Hibridaciones in situ con la sonda de
Fgf8 demuestran, molecularmente, una clara desorganización del AER en embriones
mutantes homocigotos. Esta cresta ectodérmica apical resultó más extensa en el eje dorso- ventral y más corta en el eje antero-posterior.
Se llevaron a cabo hibridaciones in situ en secciones de parafina de estos embriones con la sonda de Fgf8 y se pudo determinar que el AER formante presentaba un aspecto plano y desestructurado con un máximo de una o dos capas celulares. Sin embargo en un bajo número de embriones recogidos muertos a estadios posteriores, E10.5-11, se observaron AERs con un excesivo número de capas celulares de morfología aberrante. Los anteriores resultados revelaron un posible retraso en el proceso de maduración de AER, al menos en sus primeras etapas, no obstante parece que dicho defecto pudiera ser transitorio. Lo que parece claro es que el proceso de organización histológica de la cresta ectodérmica apical es deficiente en estos embriones pero que la facultad de esta estructura para estratificarse no se ve comprometida.
El fenotipo observado en los mutantes homocigotos de falta de función de Arid3b mostró un papel relevante de este gen en la formación de numerosas estructuras anatómicas así como en la propia viabilidad del embrión. Además, estos resultados corroboran los obtenidos en el embrión de pollo y confirman un papel conservado del gen Arid3b en el proceso de estructuración de la cresta ectodérmica apical en el desarrollo de la extremidad de vertebrado.