Roles within a Performance

En los apartados anteriores se ha intentado resumir los aspectos fundamentales del desarrollo de la extremidad en vertebrado, desde sus inicios hasta la diferenciación de sus elementos esqueléticos. El interés de nuestro laboratorio en este proceso es completo y engloba todas y cada una de las etapas descritas. Por este motivo, durante la realización de esta tesis doctoral se ha intentado mantener una visión general del desarrollo de la extremidad y el estudio llevado a cabo abarca etapas separadas en el tiempo pero íntimamente relacionadas. En un primer proyecto hemos analizado la expresión y función de un gen, Arid3b, durante la formación de la cresta ectodérmica apical mientras que paralelamente hemos ahondado en las peculiaridades asociadas a la última falange y su establecimiento.

3.1.

El proyecto de genómica comparada: Abordaje

de genes candidatos

El proyecto de genómica comparada, desarrollado en el laboratorio de Miguel Torres, surgió con el objetivo de descubrir nuevos genes implicados en la formación de patrón en la extremidad de vertebrado y comprendía diferentes abordajes. En la primera tentativa se llevó a cabo un análisis de expresión diferencial mediante microarrays en el que se comparaban las zonas de progreso de primordios de ratón a diferentes estadios. En el segundo abordaje, se desarrolló un screening de expresión, por hibridación in situ en embriones de ratón, basándonos en secuencias de vertebrados homólogas a mutantes de Drosophila melanogaster que mostraban fenotipo en ala. En esta acometida, realizada en colaboración con el grupo de Ginés Morata y José Félix de Célis en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO) se identificaron los homólogos en ratón de los genes causantes de dichos fenotipos en mosca y se diseñaron oligos, para mediante PCR, sintetizar una sonda de RNA contra estos genes candidatos. Una vez obtenida la sonda se realizaron hibridaciones in situ en embriones de ratón de diferentes estadios embrionarios y si el patrón en la extremidad resultaba sugerente se analizaba dicho gen en detalle (Fig. 26).

La hipótesis de trabajo consistía en que si un gen se encontraba implicado en la formación del ala de Drosophila, podría ocurrir que su homólogo en ratón resultase también imprescindible en el correcto desarrollo de la extremidad en vertebrado. De los aproximadamente 50 genes estudiados, Arid3b (Dril2/Bdp), uno de los homólogos del gen de Drosophila Dead ringer/Retained (Dri/Retn) en vertebrados, mostraba un patrón de expresión que incluía la cresta ectodérmica apical a lo largo de distintas etapas de desarrollo. Además otro gen de interés resultante de este análisis fue Sp8, homólogo de Buttonhead, cuyo papel en la función del AER fue demostrado poco después (Bell et al., 2003; Kawakami et al., 2004; Treichel et al., 2003).

Figura 26: Esquema del proyecto de Genómica comparada. Numerosos genes

implicados en la formación del ala de Drosophila presentan un homólogo funcional durante el desarrollo de la extremidad de vertebrado (Morata, 2001).

3.1.1. Dead ringer y ARID3b son miembros de la familia

ARID de factores de transcripción

Tanto Dead ringer como Arid3b pertenecen a la familia ARID de factores de transcripción. Dicha familia ha sido implicada en numerosos procesos biológicos como son crecimiento y diferenciación celular, control del ciclo celular o desarrollo embrionario (Kortschak et al., 2000; Wilsker et al., 2002).

Los miembros de dicha familia se caracterizan por poseer un dominio ARID (AT-rich interaction domain) de unión a DNA, una secuencia de unos 80-100 aminoácidos que codifica para un motivo hélice-giro-hélice compuesto por 6 α-hélices (H1-H6) y que muestra cierta tendencia a unirse a secuencias ricas en AT (Gregory et al., 1996; Iwahara and Clubb, 1999; Iwahara et al., 2002; Patsialou et al., 2005) (Fig. 27). Según mostró la estructura cristalográfica de este domino, el surco mayor de unión a DNA se encuentra formado por la hélice 4, el bucle 2 y la hélice 5 (Iwahara and Clubb, 1999; Iwahara et al., 2002) y ensayos con formas mutantes evidenciaron que resulta imprescindible para el correcto reconocimiento y posterior unión al DNA (Patsialou et al., 2005; Shandala et al., 2002). El dominio ARID se encuentra muy conservado a lo largo de la evolución en la mayoría de estos factores de transcripción.

Algunos integrantes de esta familia se caracterizan por poseer a cada lado del dominio ARID una secuencia conservada de unos 40 aminoácidos (H0 y H7), que parece implicada en mantener la especificidad del reconocimiento DNA-proteína (Kortschak et al., 1998) y que codifica para una α-hélice. El dominio ARID junto con estas secuencias flanqueantes se denomina dominio ARID extendido y da nombre a una

Búsqueda de homólogos en ratón Diseño de primers Síntesis de sonda Hibridación In situ Mutaciones en Drosophila

subfamilia dentro de estos factores de transcripción. Dicha subfamilia, ARID-extendida (eARID), a la que pertenecen Dead ringer y Arid3b, resulta específica de Metazoos y surgió tras su divergencia del reino Fungi.

También particular de la subfamilia eARID es la presencia de dos dominios, cercanos a la región C-terminal de la proteína, denominados RECKLESα y RECKLESβ, este último muy conservado. El primero permite la entrada al núcleo a este factor de transcripción y el segundo su salida (Kim and Tucker, 2006). Recientemente, se ha descrito la implicación del dominio RECKLESβ en la generación de complejos multiméricos de estos factores tanto consigo mismo como con otras moléculas, así como su interacción con la matriz nuclear (Kim et al., 2007). No obstante, el papel de este dominio en la formación de complejos homoméricos es motivo de controversia (Shandala et al., 2002).

3.1.2. Dead ringer/Retained en el desarrollo de Drosophila:

Dead ringer/Retained (Dri/Retn) puede ser detectado desde las primeras horas en el

desarrollo de la mosca ya que existe una distribución ubicua tanto del RNA mensajero como de la proteína de origen materno. Posteriormente el embrión comienza a expresar Dead ringer específicamente en el mesodermo durante la extensión de la banda germinal para, a continuación, en la embriogénesis, detectarse en los músculos faríngeos, glándulas salivares, en diferentes localizaciones a lo largo del tubo digestivo o en puntos concretos dentro del sistema nervioso central. En tejidos extraembrionarios, aparece en la amnioserosa, membrana encargada de cerrar la banda germinal en posición dorsal (Gregory et al., 1996).

Se han generado mutantes para Dead ringer con diferentes grados de afectación. Los mutantes hipomorfos que presentan un fenotipo más leve, alcanzan la edad adulta pero, en el caso de las hembras, exhiben trastornos relacionados con la sexualidad. Estas mutaciones puntuales ocasionan trastornos de comportamiento en el proceso de apareamiento o cortejo así como en la deposición de los huevos (Ditch et al., 2005; Schupbach and Wieschaus, 1991). El resto de los mutantes hipomorfos, además de los mutantes totales, muestran letalidad embrionaria (Shandala et al., 1999). Los primeros, únicamente sufren alteraciones en el tubo digestivo (Shandala et al., 1999) y en el posicionamiento de las células gliales en el sistema nervioso (Shandala 2003), mientras que los segundos también presentan anomalías en el desarrollo del músculo somático (Shandala et al., 1999). El caso más extremo se produce al eliminar tanto la expresión de Dead ringer en el embrión como el componente materno. En estos embriones, procesos esenciales como la segmentación embrionaria, la retracción de la banda

Figura 27: Representación esquemática que muestra los dominios de la proteína Arid3b/Dril2/Bdp.

Estos dominios se mantienen en su homólogo en Drosophila, Dead ringer/Retained.

H0 H1 β1 β2 H2 H3 H4 H5 H6 H7

germinal, o la formación de un correcto patrón en el eje antero-posterior (especialmente evidente en las regiones terminales) se ven completamente alterados. Asimismo, se han observado variaciones en los niveles de expresión de Wingless y

Engrailed durante la formación de los segmentos y de Argos y Buttonhead en las

estructuras terminales del eje antero-posterior. Además dichos especimenes carecen de un correcto desarrollo del músculo somático, del esqueleto céfalo-faríngeo y de las células pericárdicas (Shandala et al., 1999).

Previamente se determinó que Dead ringer podría estar implicado también en la generación de un adecuado patrón dorso-ventral (Hader et al., 2000; Valentine et al., 1998), permitiendo la transformación del activador transcripcional DORSAL (DL) en un represor. Dead ringer y Dorsal, conjuntamente, restringirían la expresión de Zerknüllt (Zen) a la región dorsal del embrión y evitarían la expansión de Huckebein (Hkb) del borde anterior y posterior a la totalidad del surco ventral.

Durante el desarrollo larvario, Dead ringer mantiene su patrón de expresión en la mayoría de los tejidos antes citados, sin embargo se detectaron altos niveles de esta molécula en numerosas regiones en el disco imaginal de ala, especialmente en los precursores de las sensilas campaniformes (Shandala et al., 2002). Asimismo, la sobreexpresión de una forma dominante negativa de Dead ringer en el disco imaginal de ala, genera un apéndice con borde irregular, con alteraciones en venas y pérdida de sensilas campaniformes (Shandala et al., 2002).

3.1.3. Arid3b/Bdp

Originalmente, Arid3b se aisló procedente de una librería de cDNAs de testículo humano (Numata et al., 1999) y ensayos por Northern blot determinaron expresión de dicho gen en numerosos tejidos adultos en esta especie (Numata et al., 1999) (Tabla 2).

Estudios en el campo de la oncología han demostrado la implicación de dicho gen en tumorogénesis. En primer lugar se han observado altos niveles de Arid3b en líneas celulares de diferentes tipos tumorales como leucemias eritrocíticas o neuroblastomas malignos (Kobayashi et al., 2006; Numata et al., 1999). Además, mientras que el uso de oligonucleótidos antisentido y RNA interferente contra este factor de transcripción reduce significativamente el crecimiento de neuroblastomas in vitro, su sobreexpresión en este tipo de líneas celulares aumenta la malignidad de dicho tumor en ensayos con ratón (Kobayashi et al., 2006).

Posteriormente al comienzo de esta tesis doctoral, tanto el patrón de expresión como el papel de Arid3b en embriogénesis murina fue publicado (Takebe et al., 2006).

Según este artículo este factor de transcripción se expresaría principalmente en estructuras tales como arcos branquiales, cresta neural, rombómeros, tracto de salida del corazón y vesícula ótica a diferentes estadios. En la región caudal detectaron altos niveles de Arid3b en el tubo neural y en el mesodermo así como en los somitos nacientes. El mutante de falta de función de este factor de transcripción resultaba letal embrionario a estadios E11.5-12.5 y mostraba retardo en el crecimiento, alteraciones en el cierre del tubo neural, defectos cardiovasculares, y estructuras craneofaciales anómalas, estas últimas producidas por un defecto en la supervivencia de las células del mesénquima craneal. La penetrancia del fenotipo contemplado resultó variable.

Tabla 2:

Arid3b en tejidos adultos