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7.5 Sharing Scripts and Emotional Effects with Audiences – Cultural Extension and Psychological Identification
8.3.2 Creativity, Multiple Definitions of Performance and the Resulting Ontological Insecurity
Se ha descrito que durante la diferenciación neuronal en células de ratón aumenta la expresión de miR-‐124. Para analizar si en células humanas se producía este mismo efecto se obtuvieron los RNAs de extractos solubles de células SHSY5Y no diferenciadas (Día 0) y diferenciadas (Día 7) y se analizó mediante RT-‐qPCR TaqMan la expresión de miR-‐124. En el
Figura R7: Comparación de la asociación de los 6 miRNAs seleccionados a los complejos de hStaufen1 en células SHSY5Y respecto al extracto inicial celular. Se realizó una filtración de exclusión molecular mediante
una columna de Sephacryl S-‐300 de extractos de células SHSY5Y sin diferenciar (A) y diferenciadas (C) y se obtuvieron las fracciones correspondientes. Se analizó la presencia de las proteínas Ago2 y las isoformas de hStaufen1 (hStau55 y hStau63) mediante Western blot con anticuerpos específicos que reconocen dichas
proteínas. Se agruparon las fracciones 17,18 y 19 y se aisló el RNA contenido en estas fracciones de las células sin diferenciar (B) o diferenciadas (D) y en el extracto inicial. Se analizó mediante RT-‐qPCR TaqMan la cantidad de los 6 miRNAs candidatos con respecto al extracto inicial de tres réplicas independientes. El eje de ordenadas muestra el porcentaje del valor máximo.*** p-‐value ≤0,01
panel A de la Figura R8 se observa que los niveles de miR-‐124 aumentan durante la diferenciación aproximadamente 20 veces con respecto a las células sin diferenciar.
Ya que la expresión de miR-‐124 aumenta durante la diferenciación, y sin embargo se produce una disminución de su presencia en las fracciones de hStaufen1, se decidió analizar la distribución de miR-‐124 a lo largo de la filtración en células diferenciadas y no diferenciadas. Para llevar a cabo el experimento se realizaron filtraciones de células SHSY5Y diferenciadas y no diferenciadas y se agruparon del mismo modo que en el apartado 1.2.2.3 (Figura R6) en cuatro grupos de fracciones. Se extrajeron los RNAs de dichos grupos y se analizaron por RT-‐ qPCR TaqMan para detectar la presencia de miR-‐124. Se puede observar en la Figura R9 que miR-‐124 se distribuye preferentemente en el grupo de fracciones F3 en células diferenciadas, donde se encuentra la mayor fracción de Ago2 y RCK/p54. Estos resultados muestran que durante la diferenciación, miR-‐124 aumenta su expresión y su distribución cambia hacia gránulos celulares de menor tamaño.
Figura R8: Análisis de la asociación de miR-‐124 a los complejos de hStaufen1 en células SHSY5Y y niveles de expresión en células diferenciadas y no diferenciadas. (A) Representación gráfica de la cantidad de miR-‐124
en las fracciones correspondientes a los gránulos de hStaufen1 con respecto al extracto inicial en neuroblastos diferenciados y no diferenciados (* p-‐value ≤ 0,05). (B) Se sembraron células SHSY5Y y se indujo la diferenciación de una fracción de éstas. Se obtuvo el RNA total y se analizó la expresión de miR-‐124 por RT-‐ qPCR TaqMan. La gráfica muestra el porcentaje del valor máximo de la expresión de miR-‐124 de células SHSY5Y diferenciadas y no diferenciadas.
Como se ha podido observar en la Figura R7, la distribución de los complejos de hStaufen1 y Ago2 no cambia en células diferenciadas y no diferenciadas. Sin embargo, tal y como se puede apreciar en la Figura R8A, mientras que la isoforma de 55kDa de hStaufen1 se presenta como la mayoritaria en células sin diferenciar (Día 0), los niveles de las isoformas de 63kDa y 55kDa son prácticamente iguales en células diferenciadas (7 días) (Figura R8C). La cuantificación por densitometría de ambas bandas en las dos condiciones muestra como durante la diferenciación neuronal se produce un cambio en la expresión de las isoformas de hStaufen1 siendo mayoritaria la isoforma de 55kDa en células sin diferenciar y prácticamente iguales en células diferenciadas. (Figura 9B).
2-‐PAPEL DE hSTAUFEN1 EN DIFERENCIACIÓN NEURONAL
En los ratones transgénicos Stau1(tm1Apa), se observa una disminución en el número de ramificaciones dendríticas en células neuronales a partir del orden dendrítico secundario (Vessey et al, 2008). Por otra parte, se ha publicado que dos de los 6 miRNAs asociados a hStaufen1 en células neuronales (miR-‐124 y miR-‐9) son importantes para la correcta diferenciación de neuronas y son esenciales para la conversión de fibroblastos de ratón en células neuronales (Yoo et al, 2009; Yoo et al, 2011). Además, los resultados previos de esta Tesis indican que los niveles de miR-‐124 disminuyen en los complejos de hStaufen1 durante la
Figura R9: Presencia de miR-‐124 en los distintos gránulos celulares en células diferenciadas y no diferenciadas. (A) Se realizó una filtración de exclusión molecular mediante una columna de Sephacryl S-‐400
de extractos de células SHSY5Y sin diferenciar y diferenciadas durante 10 días y se agruparon las fracciones en 4 grupos según se indica en la figura R6. Se aisló el RNA de cada fracción y se analizó la presencia de miR-‐124 por RT-‐qPCR TaqMan. La gráfica muestra el porcentaje del valor máximo de la cantidad total de miR-‐124 de cada fracción (* p-‐value ≤ 0,05). (B) Se realizó una filtración de exclusión molecular y las fracciones se revelaron con anticuerpos específicos para hStaufen1. Se cuantificó por densitometría las dos isoformas de hStaufen1, 55KDa y 63KDa, en células diferenciadas y no diferenciadas. El eje de ordenadas muestra la división entre la cuantificación de la isoforma de 55KDa y la de 63KDa. El eje de abscisas muestra los días de diferenciación. * indica un p-‐value ≤ 0,05.
diferenciación neuronal en células de neuroblastoma humano. Todos estos datos sugieren que hStaufen1 podría participar en la correcta diferenciación de neuronas en humanos y por tanto se decidió estudiar su relevancia durante este proceso.
2.1 Generación de una línea estable de neuroblastoma humano silenciable para hStaufen1