4.4 Research Method and Design
4.4.2 Data Analysis
ectodérmica apical de embriones de pollo
electroporados
Se analizaron los niveles de proliferación y muerte celular en la cresta ectodérmica apical en embriones de pollo electroporados con el plásmido de sobreexpresión de la forma wt de Arid3b y en embriones electroporados con los plásmidos de sobreexpresión de las formas dominantes negativas. Con el fin de delimitar la cresta ectodérmica apical, tanto en los primordios electroporados como en los controles, se realizaron hibridaciones in situ en secciones de parafina con la sonda de Fgf8 en las muestras manipuladas. Además en otro conjunto de secciones se llevaron a cabo ensayos inmunohistoquímicos con el anticuerpo anti-GFP para identificar las células electroporadas. Aunque los resultados finales vienen resumidos a continuación, la totalidad de los datos obtenidos pueden ser consultados en la tabla suplementaria 1a dentro del apartado Material suplementario.
Figura 53: A) Hibridaciones in situ en secciones
transversales de especimenes Arid3b-/- con la sonda de Shh
muestran una expresión normal de este gen en estos embriones. B) El mutante de Shh a E10.5 presenta un fenotipo evidente en esa etapa de desarrollo. C) Arid3b se expresa con normalidad en primordios de la extremidad de ejemplares Shh-/- pero no se detecta en el floorplate (Fp.) ni
en la notocorda (Not.) de la región anterior del embrión. D) En la región posterior Arid3b se expresa con normalidad en la totalidad del tubo neural (Tn.) y en la notocorda (Not.).
• Apoptosis en el AER de embriones de pollo electroporados con el plásmido de sobreexpresión de la forma wt de Arid3b.
Se electroporaron embriones de pollo de estadio 10-11HH y se recogieron a 30 horas de incubación (n=3). Se llevó a cabo un ensayo de TUNEL en secciones de parafina y se procedió al recuento de las células positivas situadas en la cresta ectodérmica apical tanto de los primordios electroporados como en los contralaterales. El resultado de estos experimentos indicó que no existía una variación significativa en el porcentaje de células apoptóticas en los AERs de los primordios electroporados respecto a los controles (Fig. 54).
• Proliferación en el AER de embriones de pollo electroporados con el plásmido de sobreexpresión de la forma wt de Arid3b.
Embriones de pollo de estadio 10-11HH fueron electroporados y recogidos a 30 horas post-electroporación (n=3). Previamente a la recolección de los embriones se inyectó BrdU a 5mg/l a los especimenes electroporados y se incubaron durante 30 minutos. En los embriones elegidos se llevó a cabo la detección del BrdU incorporado y se contaron las células positivas situadas en la cresta ectodérmica apical en los primordios electroporados y en sus respectivos controles. No se detectó una alteración en los porcentajes de células proliferativas en los AERs de los primordios electroporados en comparación con los controles (Fig. 55).
Figura 54: Estudio de
apoptosis (TUNEL) en AERs de primordios de embriones electroporados con Arid3b y recogidos a 30 horas postelectroporación. A) Ensayo de TUNEL en una sección del primordio no electroporado. B) Ensayo de TUNEL en una sección del primordio electroporado con la forma wt de Arid3b y recogido a las 30 horas. C y D) Hibridación in situ con la sonda de Fgf8 en secciones consecutivas a las anteriores. E) No se detectaron diferencias significativas con respecto a los primordios contralaterales (p ≥ 0,05).
En resumen, los ensayos en embriones electroporados con el plásmido de sobreexpresión de Arid3b indicaron que los niveles de muerte y proliferación en estos especimenes son comparables a los detectados en primordios control.
• Apoptosis en el AER de embriones de pollo electroporados con el plásmido de sobreexpresión de las formas dominantes negativas de Arid3b.
Como se observó que los fenotipos detectados con una u otra forma dominante negativa eran indistinguibles, se electroporaron indistintamente los plásmidos cArid3bDNhW y cArid3bDNY312A en embriones de pollo de estadio 10-11HH y se
recogieron a diferentes tiempos post-electroporación, 30 y 72 horas. Los embriones con alta expresión de GFP fueron escogidos preferentemente en ensayos a tiempos cortos (30 horas) y especimenes con fenotipo evidente en el AER fueron seleccionados a 72 horas. Sobre dichas muestras se realizó un estudio de apoptosis mediante TUNEL y se computaron las células apoptóticas del AER de los primordios manipulados y de sus controles. Con los resultados que se obtuvieron a 30 horas post-electroporación (n=3), se pudo concluir que no existían diferencias en el porcentaje de células TUNEL-positivas en los AERs de los primordios electroporados respecto a los primordios contralaterales a estos tiempos de incubación (Fig. 56). Sin embargo los datos derivados de los ensayos realizados a 72 horas post-electroporación (n=3) indicaron que los AERs de los primordios electroporados presentaban unos niveles prácticamente indetectables de muerte celular frente a los niveles normales observados en los controles(Fig. 58).
Figura 55: Estudio de
proliferación celular (BrdU) en AERs de primordios de embriones electroporados con Arid3b y recogidos a 30 horas postelectroporación. A) Células BrdU positivas en una sección del primordio no electroporado. B) Ensayo de proliferación en una sección del primordio electroporado con la forma wt de Arid3b y recogido a las 30 horas. C y D) Hibridación in situ con la sonda de Fgf8 en secciones consecutivas a las anteriores. E) No se detectaron diferencias significativas con respecto a los primordios contralaterales (p ≥ 0,05).
Figura 56: Estudio de
apoptosis (TUNEL) en AERs de primordios de embriones electroporados con formas dominantes negativas de
Arid3b y recogidos a 30 horas
postelectroporación. A) Ensayo de TUNEL en una sección del primordio no electroporado. B) Ensayo de TUNEL en una sección del primordio electroporado con formas dominantes negativas de Arid3b y recogido a las 30 horas. C y D) Hibridación in
situ con la sonda de Fgf8 en
estas secciones. E) No se detectaron diferencias significativas con respecto a los primordios contralaterales (p ≥ 0,05).
Figura 57: Estudio de
proliferación celular (BrdU) en AERs de primordios de embriones electroporados con formas dominantes negativas de Arid3b y recogidos a 30 horas postelectroporación. A) Proliferación celular en una sección del primordio no electroporado. B) Células BrdU positivas en una sección del primordio electroporado con formas dominantes negativas de Arid3b y recogido a las 30 horas. C y D) Hibridación in situ con la sonda de Fgf8 en secciones consecutivas a las anteiriores. No se detectaron diferencias significativas con respecto a los primordios contralaterales (p ≥ 0,05).
Figura 58: Estudio de
apoptosis (TUNEL) en AERs de primordios de embriones electroporados con formas dominantes negativas de
Arid3b y recogidos a 72 horas
postelectroporación. A) Células TUNEL-positivas en una sección del primordio no electroporado. B) Ensayo de apoptosis en una sección del primordio electroporado con formas dominantes negativas de Arid3b y recogido a las 72 horas. C y D) Hibridación in
situ con la sonda de Fgf8 en
estas secciones. E) Los niveles de muerte celular en los primordios electroporados son mucho menores con respecto a los primordios contralaterales (p ≤ 0,05).
Figura 59: Estudio de
proliferación celular (BrdU) en AERs de primordios de embriones electroporados con formas dominantes negativas de Arid3b y recogidos a 72 horas postelectroporación. A) Células BrdU-positivas en una sección del primordio no electroporado. B) Ensayo de proliferación en una sección del primordio electroporado con formas dominantes negativas de Arid3b y recogido a las 72 horas. C y D) Hibridación in situ con la sonda de Fgf8 en secciones consecutivas a las anteriores. E) No se detectaron diferencias significativas con respecto a los primordios contralaterales (p ≥ 0,05).
• Proliferación en el AER de embriones de pollo electroporados con el plásmido de sobreexpresión de las formas dominates negativas de cArid3b.
Embriones de pollo de estadio 10-11HH fueron electroporados con las construcciones cArid3bDNhW y cArid3bDNY312A y recogidos a diferentes tiempos
post-electroporación, 30 horas y 72 horas. A 30 horas se seleccionaron muestras con altos niveles de GFP en el ectodermo y a 72 horas se escogieron embriones que visualmente mostraban fenotipo en la cresta ectodérmica apical. Posteriormente se llevó a cabo el ensayo de proliferación mediante detección de BrdU incorporado. Se contaron las células proliferativas pertenecientes al AER, tanto de los primordios electroporados, como en los primordios control. El resultado de los ensayos a tiempos cortos no reveló una variación en los niveles de proliferación estadísticamente significativa (Fig. 57). A 72 horas las células de la cresta ectodérmica apical de los primordios electroporados mostraron un ligero incremento en la tasa proliferativa, sin embargo tras el análisis estadístico se determinó que no era significativo (Fig 59).
En conclusión, se puede determinar que los niveles de muerte y proliferación observados en el AER de embriones electroporados con las construcciones cArid3bDNhW y cArid3bDNY312A a 30 horas post-electroporación son semejantes a los
detectados en las muestras control. Esto sugiere que a tiempos cortos, en etapas cercanas a la formación del AER, los embriones electroporados no muestran ninguna variación en la tasa proliferación/muerte. Sin embargo, a tiempos largos (72 horas), los niveles de muerte en la cresta ectodérmica apical de los embriones electroporados están claramente reducidos. Tras el análisis de estos datos, y teniendo en cuenta la dinámica de aparición del fenotipo, parece que la muerte y proliferación celular no son los causantes de las anomalías observadas en la cresta ectodérmica apical de los ensayos de ganancia y pérdida de función en el embrión de pollo. Asimismo, las variaciones observadas a 72 horas podrían resultar la consecuencia, y no la causa, de un defecto en la maduración o morfogénesis del AER producido con anterioridad.
1.5.3. Estudio del papel de Arid3b en la morfogénesis del
AER. Estudios de proliferación y muerte en la cresta
ectodérmica apical de embriones mutantes Arid3b
-/-De manera similar al pollo, se llevó a cabo un estudio de los valores de apoptosis y proliferación en la cresta ectodérmica apical de embriones mutantes homocigotos Arid3b-/-. Los resultados finales vienen resumidos en este apartado, sin embargo la
totalidad de los datos obtenidos pueden ser consultados en la Tabla suplementaria 1 de la sección Material suplementario.
• Apoptosis en el AER de embriones mutantes homocigotos Arid3b-/-.
A partir de embriones Arid3b-/- de estadio E10.5 (n=3) y de sus respectivas
muestras control (n=3), se realizaron secciones consecutivas para dos técnicas diferentes. En parte de estas secciones se realizó un ensayo de TUNEL tal y como se describe en el apartado Materiales y Métodos. En el resto de secciones, y para poder determinar la localización exacta de la cresta ectodérmica apical, se llevó a cabo una hibridación in situ en secciones con la sonda de Fgf8. Se procedió al recuento de células TUNEL-positivas en el AER tanto de embriones como de los
controles y se concluyó que los especimenes mutantes presentaban un 64% menos de muerte que los individuos control (Fig. 60). Sorprendentemente, cabe destacar que, la inmensa mayoría de los tejidos de los embriones Arid3b-/- de estadio E10.5
presentaban niveles de apoptosis muy superiores comparados con las muestras control.
• Proliferación en el AER de embriones mutantes homocigotos Arid3b-/-.
En embriones Arid3b-/- de estadio E10.5 (n=3) y en embriones control (n=3) se
realizaron ensayos de proliferación con fosfohistona-3 (PH3). Como método para establecer la ubicación del AER se realizó una hibridación en secciones con la sonda de Fgf8. Se contaron todas las células PH3-positivas situadas en la cresta ectodérmica apical de estos especimenes y se pudo concluir que los embriones mutantes mostraban un 56% menos de proliferación celular que sus homólogos control (Fig. 61). Este defecto en proliferación parece producirse, además en el mesénquima de la extremidad y otras estructuras.
De estos resultados se pudo deducir que existe un descenso tanto en la tasa de proliferación celular como de muerte celular en embriones mutantes Arid3b-/- respecto
a los controles en el AER. Sin embargo la relación muerte/proliferación mantienen valores similares a los observados en las muestras control, indicando una preservación en cuanto al equilibrio celular se refiere, al menos a tiempos cortos.
Figura 60: Estudio de
apoptosis (TUNEL) en AERs de embriones Arid3b-/-. A y
C) Secciones consecutivas de embriones wt control en las que se ha llevado a cabo un ensayo de TUNEL y una hibridación in situ con la sonda de Fgf8. B y D) Secciones consecutivas de embriones Arid3b-/- en las que
se ha realizado un ensayo de muerte celular y una hibridación in situ con la sonda de Fgf8. E) Este parámetro se encuentra significativamente disminuido en estos ejemplares con respecto a los especimenes control (p ≤ 0,05).
Estos datos sugieren que el fenotipo observado en la cresta ectodérmica apical de embriones mutantes no es el producto de una anomalía en la relación muerte/proliferación de las células que componen el AER. Sugerimos que la disminución de los valores absolutos podría ser un reflejo del fenotipo general del mutante.