No existe una metodología universal que pueda ser aplicada a la hora de inmovilizar un biocatalizador. Por norma general, el procedimiento seguido se basa en la técnica de ‘prueba y error’, siendo el factor principal a tener en cuenta la estabilidad y actividad del enzima tanto en el proceso de inmovilización como en su posterior utilización. Las técnicas de inmovilización enzimática más frecuentes suelen agruparse principalmente en tres grupos, presentando cada uno de los métodos ciertas ventajas e inconvenientes.
0.2.2.1. Adsorción no covalente
Se puede realizar mediante diferentes tipos de interacciones inespecíficas. Así, enzimas con grandes superficies lipofílicas pueden interaccionar con soportes hidrofóbicos a través de uniones de tipo van der Waals.90 También se pueden inmovilizar sobre soportes hidrofílicos mediante enlaces de hidrógeno con alguno de los residuos polares que el biocatalizador posea en la superficie.91 Una de las ventajas de usar este tipo de inmovilización es que el enzima no necesita un tratamiento previo y
90 L. Cao, Carrier-bound Immobilized Enzymes, Wiley-VCH, Weinheim, 2005.
91 C. Mateo, J. M. Palomo, G. Fernandez-Lorente, J. M. Guisan, R. Fernandez-Lafuente, Enzyme Microb. Technol. 2007, 40, 1451-1463.
puede ser utilizado directamente sin necesidad de aislamiento o purificación. Esta inmovilización presenta como desventaja la pérdida de la proteína en las reutilizaciones (“leaching”).
Dentro de este grupo se pueden incluir las inmovilizaciones a través de enlaces iónicos, puesto que dependiendo del pH del medio, determinados aminoácidos de la superficie del biocatalizador pueden encontrarse cargados. Debido a esta característica, y utilizando como soporte un intercambiador iónico adecuado, se pueden conseguir interacciones fuertes de tipo polar (Figura 0.7a).92 La cohesión resina-enzima en este tipo de anclaje depende enormemente del pH y de la fuerza iónica del medio.
0.2.2.2. Encapsulamiento
La manera más segura de evitar influencias negativas sobre la estructura de la proteína es encapsulándola. Este método se ha estudiado ampliamente siendo la técnica de tipo ‘sol-gel’ la más comúnmente empleada.93 En este caso la proteína se confina físicamente dentro de una matriz polimérica supramolecular. El material obtenido, además de poseer una gran estabilidad térmica y mecánica, resulta ser muy poroso con lo que el sustrato puede difundir fácilmente hasta llegar a la proteína, la cual no puede a su vez salir hacia el medio de reacción puesto que tiene un tamaño mucho mayor que el de los poros del material.
Durante los últimos años ha cobrado una importancia relevante la utilización de polimersomas como medios de encapsulamiento de enzimas y de otro tipo de biomoléculas como pueden ser fármacos o marcadores.94 Un polimersoma está formado por copolímeros de bloque anfifílicos, y de igual modo que los liposomas, en medios acuosos se alinean en bicapas formando esferas capaces de almacenar diferentes sustancias en su interior (Figura 0.7b). Al contrario que los liposomas, formados por fosfolípidos de pequeño tamaño, los polimersomas están constituidos por copolímeros
92 A. Basso, B. A. Maltman, S. L. Flitsch, G. Margetts, I. Brazendale, C. Ebert, P. Linda, S. Verdellia, L. Gardossi, Tetrahedron 2005, 61, 971-976.
93 (a) D. Avnir, T. Coradin, O. Lev, J. Livage, J. Mater. Chem. 2006, 16, 1013-1030; (b) A. C. Pierre, Biocatal. Biotransform. 2004, 22, 145-170.
94 (a) S. A. Meeuwissen, A. Rioz-Martínez, G. de Gonzalo, M. W. Fraaije, V. Gotor, J. C. M. van Hest, J. Mater. Chem. 2011, 21, 18923-18926; (b) M. Nallani, H.-P. M. de Hoog, J. J. L. M. Cornelissen, A. R. A.
Palmans, J. C. M. van Hest, R. J. M. Nolte, Biomacromolecules 2007, 8, 3723-3728; (c) D. E. Discher, A. Eisenberg, Science 2002, 297, 967-973.
de alto peso molecular y poseen una mayor estabilidad y resistencia mecánica. Además estos copolímeros pueden ser modificados fácilmente consiguiendo así polimersomas con diferentes propiedades.
0.2.2.3. Enlace covalente
En este caso el biocatalizador se encuentra covalentemente unido al soporte (Figura 0.7c), favoreciendo en algunos casos la estabilización de la proteína ya que con la formación de los enlaces covalentes la flexibilidad conformacional del enzima disminuye, y debido a ello, puede tolerar condiciones más drásticas de temperatura y de pH. Por otro lado, como el biocatalizador se modifica químicamente cuando se une al soporte, existe un mayor riesgo de pérdida de actividad.
La forma tradicional para realizar este anclaje consiste en el aprovechamiento de la nucleofilia de los grupos amino existentes en la superficie del enzima. Así, se les hace reaccionar con un conector (“linker”) que ya se encuentra unido a la resina. Como conector se suele utilizar una molécula bifuncionalizada que pueda unirse por un extremo al soporte y por el otro a alguno de los grupos amino de la proteína (suelen emplearse diepóxidos, dialdehídos como el glutaraldehído o también anhídridos de ácido cíclicos como el anhídrido maléico).95 En el caso de que la reacción se haga sobre
un dialdehído, las iminas formadas pueden ser reducidas con el fin de obtener enlaces covalentes más estables.
El conector juega un papel clave en la inmovilización, ya que si se usan conectores de cadena carbonada larga, la flexibilidad del biocatalizador será mayor puesto que podrá variar su conformación con una mayor facilidad.96 En cambio, si posee una cadena carbonada corta, las interacciones del enzima con el soporte serán mayores restringiendo así su movilidad pero confiriendo una mayor estabilidad térmica a la proteína.
95 J. M. S. Cabral, J. F. Kennedy, en Protein Immobilization: Fundamentals and Applications, Ed. R. F. Taylor, Marcel Dekker, Nueva York, 1991.
96 A. Basso, P. Braiuca, S. Cantone, C. Ebert, P. Linda, P. Spizzo, P. Caimi, U. Hanefeld, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 877-886.
Dentro de este tipo de inmovilizaciones se puede incluir la realizada mediante
entrecruzamiento (Figura 0.7d). Este es un caso extremo de unión covalente en el cual
las proteínas en disolución se entrelazan entre sí empleando un agente químico bifuncionalizado, como por ejemplo el glutaraldehído, quedando unidas unas a otras mediante enlaces de tipo covalente. En este método, en lugar de anclar el enzima a un soporte externo, se forman agregados enzimáticos (en inglés “Cross-Linked Enzyme
Aggregates”, CLEA) obviándose los problemas derivados del empleo de las
resinas,88d,97 aunque este método presenta como contrapartida una mayor probabilidad de pérdida en la actividad enzimática puesto que es una metodología que puede modificar en gran medida la estructura tridimensional del biocatalizador. Más recientemente se han desarrollado nuevos preparados que combinan el entrecruzamiento de más de un enzima, las llamadas combi-CLEAs.98
97 L. Cao, F. Van Rantwijk, R. A. Sheldon, Org. Lett. 2000, 2, 1361-1364.
98 (a) S. Van Pelt, F. Van Rantwijk, R. A. Sheldon, Adv. Synth. Catal. 2009, 351, 397-404; (b) S. Dalal, M. Kapoor, M. N. Gupta, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2007, 44, 128-132.
Figura 0.7. Ejemplos de inmovilización enzimática. a) Inmovilización por enlace iónico. b)
Encapsulamiento en el interior de micelas. c) Inmovilización covalente a través de un conector. d) Entrecruzamiento (por ej., CLEAs)