La PAMO (EC 1.14.13.92) es un enzima termoestable ya que ha sido aislado de la bacteria mesotermófila Thermobifida fusca. Pertenece al tipo I de las BVMOs, por lo que tiene FAD como grupo prostético y requiere NADPH como cofactor.154 Además, es la primera BVMO cuya estructura ha sido elucidada por rayos X.155 Es una proteína
153 Algunas revisiones y ejemplos recientes: (a) M. D. Truppo, G. Hughes, Org. Process Res. Dev. 2011, 15, 1033-1035; (b) M. L. E. Gutarra, C. Mateo, D. M. G. Freire, F. A. G. Torres, A. M. Castro, J. M.
Guisan, J. M. Palomo, Catal. Sci. Technol. 2011, 1, 260-266; (c) P. Saunders, J. Brask, en Biocatalysis in
Polymer Chemistry, Ed. K. Loos, Wiley-VCH, Weinheim, 2011, pp. 65-82; (d) S. J. Pierre, J. C. Thies,
A. Dureault, N. R. Cameron, J. C. M. van Hest, N. Carette, T. Michon, R. Weberskirch, Adv. Mater. 2006, 18, 1822-1826.
154 M. W. Fraaije, J. Wu, D. P. H. M. Heuts, E. W. van Hellemond, J. H. Lutje Spelberg, D. B. Janssen, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 66, 393-400.
155 E. Malito, A. Alfieri, M. W. Fraaije, A. Mattevi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101, 13157- 13162.
monomérica de 64 kDa. Como se muestra en la Figura I.8, su estructura cristalina revela la presencia de dos dominios, uno de enlace con el NADPH y otro con el FAD, los cuales son típicos en todas las oxidorreductasas que contienen este grupo prostético. Además posee un tercer subdominio helicoidal típico de las BVMOs de tipo I. Los resultados obtenidos muestran la existencia de dos residuos cruciales (Arg217 y Lys336) en el reconocimiento de la adenina y el grupo 2’-fosfato del NADPH, respectivamente, lo que explica la mayor preferencia por este cofactor frente al NADH.
Figura I.8. Estructura de la PAMO conteniendo el cofactor pirimidínico obtenida por
difracción de rayos X (PDB: 2YLR)
Una propiedad interesante de la PAMO es su activación cuando es incubada a elevadas temperaturas. Así, cuando el enzima se incuba a 50ºC durante una hora, su actividad se dobla. Este biocatalizador presenta un intervalo de pH óptimo entre 7.0 y 9.0 para la oxidación de la fenilacetona, su sustrato modelo. Como se ha demostrado recientemente, el pH del medio tiene un efecto muy importante en la selectividad de la PAMO.156
Esta BVMO muestra una clara afinidad por los sustratos aromáticos, aunque también es capaz de aceptar otros derivados alifáticos y de llevar a cabo la oxidación de sulfuros y sulfóxidos orgánicos,157 aminas y compuestos borados.158 También se ha
156 F. Zambianchi, M. W. Fraaije, G. Carrea, G. de Gonzalo, C. Rodríguez, V. Gotor, G. Ottolina, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1327-1331.
157 G. de Gonzalo, D. E. Torres Pazmiño, G. Ottolina, M. W. Fraaije, G. Carrea, Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 3077-3083.
llevado a cabo con éxito la resolución cinética de una serie de compuestos carbonílicos aromáticos racémicos mediante oxidación enzimática de Baeyer-Villiger (Esquema I.3). Así, se obtuvieron los mejores resultados con bencilcetonas α-sustituidas racémicas como sustratos de partida. En todos los casos, se sintetizaron los ésteres de configuración S con elevadas enantioselectividades en tiempos cortos de reacción.159 En todos los casos anteriormente comentados se utilizó la G6PDH junto con la glucosa-6- fosfato para reciclar el cofactor de nicotinamida.
Esquema I.3. Oxidación enantioselectiva de cetonas racémicas catalizada por la PAMO
utilizando G6PDH para reciclar el cofactor nicotinamídico
Hay que reseñar también con respecto a esta BVMO que, a diferencia de otros enzimas de esta clase, es muy estable frente a disolventes orgánicos160 y por ello ha recibido una gran atención en estudios de evolución dirigida y mutagénesis para obtener nuevas BVMOs con mejores propiedades en cuanto a selectividad y actividad.161
Recientemente, se han comenzado a desarrollar proteínas quiméricas empleando un constructo que lleva el gen que codifica la BVMO junto con un pequeño fragmento de material genético que codifica una pequeña cadena espaciadora polipeptídica además del enzima que regenera el cofactor (como por ejemplo, una fosfito deshidrogenasa, PTDH). Una vez expresada en la célula huésped, esta proteína quimérica regenera
158 P. B. Brondani, G. de Gonzalo, M. W. Fraaije, L. H. Andrade, Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 2169- 2173.
159 (a) C. Rodríguez, G. de Gonzalo, M. W. Fraaije, V. Gotor, Tetrahedron: Asymmetry 2007, 18, 1338- 1344; (b) C. Rodríguez, G. de Gonzalo, D. E. Torres Pazmiño, M. W. Fraaije, V. Gotor, Tetrahedron:
Asymmetry 2009, 20, 1168-1173.
160 (a) F. Secundo, S. Fiala, M. W. Fraaije, G. de Gonzalo, M. Meli, F. Zambianchi, G. Ottolina, Biotechnol. Bioeng. 2011, 108, 491-499; (b) A. Rioz-Martínez, G. de Gonzalo, D. E. Torres Pazmiño, M.
W. Fraaije, V. Gotor, Eur. J. Org. Chem. 2009, 2526-2532; (c) C. Rodríguez, G. de Gonzalo, D. E. Torres Pazmiño, M. W. Fraaije, V. Gotor, Tetrahedron: Asymmetry 2008, 19, 197-203; (d) F. Schulz, F. Leca, F. Hollmann, M. T. Reetz, Beilstein J. Org. Chem. 2005, 1, 10.
161 (a) H. L. van Beek, G. de Gonzalo, M. W. Fraaije, Chem. Commun. 2012, 48, 3288-3290; (b) M. T. Reetz, S. Wu, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 15424-15432; (c) D. E. Torres Pazmiño, R. Snajdrova, D. V. Rial, M. D. Mihovilovic, M. W. Fraaije, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1361-1368.
+ O2 + H+ PAMO NADPH NADP+ G6PDH glucosa-6-fosfato gluconato-6-fosfato + H2O R2 O R1 X R2 O R1 X O R1 X R2 O +
internamente el NADPH usado por la monooxigenasa comportándose de manera autosuficiente.162 Un ejemplo de este tipo de quimera es la PAMO-CRE2 (fusión entre
la fenilacetona monooxigenasa y una fosfito deshidrogenasa), que además fue encapsulada utilizando un polimersoma como soporte.94a De esta manera se crearon nanoreactores que contenían dicho enzima y que eran capaces de llevar a cabo la oxidación de Baeyer-Villiger regenerando el cofactor pirimidínico de manera autosuficiente. En este estudio se comparó su actividad con la PAMO y la G6PDH como sistema de regeneración en disolución, comprobándose que existía una mayor actividad con la monooxigenasa fusionada encapsulada, llegándose a una conversión completa con la fenilacetona tras 15 h de reacción. También se observó una buena actividad para los casos en los que se encapsuló la G6PDH junto con la PAMO en el interior del polimersoma o solamente la G6PDH añadiendo la PAMO a la disolución. En cambio, cuando la monooxigenasa se inmovilizó de manera covalente sobre el polimersoma que contenía la G6PDH, la actividad enzimática del complejo formado descendió drásticamente.