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En el interior de las células eucarióticas (como las humanas) encontramos unos pequeños orgánulos llamados mitocondrias con una característica que los hace únicos: poseer material genético propio, denominado ADN mitocondrial. Este tipo de ADN posee tres características que lo hacen muy interesante y útil en los estudios forenses y de filiación humana:

El número de mitocondrias, aunque variable dependiendo del tipo celular y del estado funcional en que se encuentran, oscila entre las 100 y las 1.000 por célula. Si a ello añadimos que cada mitocondria presenta de 2 a 10 copias de ADNmt nos encontramos con

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un número grande de copias por célula (entre las 100 y las 10.000), lo que incrementa la probabilidad de que algunas de ellas se conserven integras en el tiempo sin verse afectadas por los procesos de degradacion.

El ADN mitocondrial es de tamaño muy pequeño (16.569 pb.), con diferente distribución en las dos cadenas. La cadena pesada (Heavy chain, H) es rica en purinas, mientras que la cadena ligera (Light chain, L) es rica en pirimidinas, circular, ya que se obtiene a partir de un organelo celular y se encuentra dentro de las mitocondrias es de linaje materno presente con múltiples copias idénticas dentro de una misma célula y puede aplicarse en aquellas muestras que se encuentran en cantidades mínimas antiguas y degradadas y se hereda exclusivamente por vía materna (hermanos primos, hijos de hermanas de la madre) (Lorente Acosta et. al, 1996).El ADNmt es un tipo de material genético extranuclear que contiene información relativa a la síntesis de componentes de la respiración celular, y que se hereda íntegra y exclusivamente por línea materna. Puesto que en este caso no existe aportación genética mixta del padre y de la madre, como sucede con el ADN nuclear o cromosómico, el ADN mitocondrial se transmite invariable de generación en generación, siendo las mutaciones que ocurren espontáneamente en él la única fuente de variabilidad a lo largo del tiempo. ( Fernandez D. et al., 2011)

Una ventaja importante de mtDNA es que se produce en un número alto de copias desde algunos cientos hasta miles de copias por célula humana dependiendo del tipo de célula (en comparación con dos copias de cada autosoma por célula y una copia del cromosoma Y por célula masculina). Esta característica molecular aumenta la probabilidad de que el ADNmt suficientemente intacto sobreviva a los procesos de degradación post mortem (Kayser, 2007).

Además de contener en su mayor parte información vital para el desarrollo de las funciones mitocondriales. Además de estas zonas codificantes, la molécula presenta varias zonas no

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codificantes, siendo éstas las realmente importantes en los estudios forenses. De estas cabe destacar la más larga: el lazo D-loop o asa de desdoblamiento, de 1.200 pares de bases de longitud y que presenta una frecuencia de mutación cinco veces mayor a la del resto del genoma mitocondrial. En este asa existen dos regiones especialmente hipervariables denominadas región hipervariable 1 (HV1) y región hipervariable 2 (HV2), estudiadas como pauta habitual en los laboratorios forenses. Su alta variabilidad las hace idóneas para la diferenciación entre líneas familiares y los estudios de parentesco.

Figura 20.Región hipervariable I y II área de estudio polimórfica del genoma mitocondrial. Fuente: Extraído

de (Mark A., 2004).

Cabe destacar su herencia prácticamente por vía materna. Parece ser que únicamente las mitocondrias que proceden de la madre se perpetúan en el cigoto, y con ellas su carga genética. Las mitocondrias paternas o no llegan a ser transmitidas al cigoto o son marcadas y destruidas en los procesos de diferenciación celular que se producen tras la fecundación. Por tanto, cada individuo posee la información genética mitocondrial heredada de su madre. Este hecho nos permite estudiar individuos que aun no estando relacionados directamente compartan un ancestro por vía materna, permitiendo tanto la identificación de cadáveres a partir de familiares (ascendientes o descendientes por vía materna), como los estudios de parentesco entre individuos vivos. El ADN mitocondrial (ADN mit.) ha pasado a ser una herramienta fundamental en el ámbito de la genética desde finales del siglo XX, siendo de especial interés en genética forense y genética de poblaciones.

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Sea cual sea la aplicación del estudio del ADNmt, su análisis se basa en primer lugar en la comparación con una secuencia de referencia. Durante muchos años, la secuencia original de Anderson o secuencia de referencia de Cambridge (CRS) fue la secuencia de referencia con la que se comparaban nuevas secuencias. En 1999, el material placentario original usado por Anderson (1981) para generar la CRS fue re-secuenciado. La secuencia obtenida en 1981 derivó principalmente de un individuo de descendencia europea; sin embargo, también contenía algunas secuencias HeLa y bovinas que rellenaron los huecos originados por los procedimientos rudimentarios de secuenciación de ADN de aquél entonces. Con las mejoras en la tecnología de secuenciación de ADN que tuvieron lugar durante las dos décadas siguientes, se asumió que se debían rectificar los errores originales para permitir un uso más robusto de la secuencia de referencia en el futuro. El análisis posterior confirmó todos los nucleótidos de la secuencia original publicada excepto 11 posiciones de la región codificante, mientras que no se encontró ningún error en la región control. Esta nueva secuencia llamada la secuencia de referencia de Cambridge revisada (rCRS) es actualmente el estándar aceptado para la comparación.

Al igual que el ADN nuclear, el ADNmt presenta dos regiones, una región codificante y una no codificante, también llamada región control o D-loop. La región codificante, que representa el 90% del genoma mitocondrial, contiene 37 genes, 13 de los cuales codifican para polipéptidos involucrados en la cadena de fosforilación oxidativa, y el resto para 22 moléculas de tARN y 2 de rARN (12S y 16S). .

Por otro lado, la región no codificante que alberga tan solo unas 1,2 kb, contiene el origen de la replicación de la cadena H, el origen de la transcripción de ambas cadenas y regiones reguladoras para la replicación y transcripción. Esta región es muy polimórfica y presenta dos regiones hipervariables bien caracterizadas, la HVSI y HVSII, de unas 400 bp cada una. Existe una tercera región hipervariable, la HVSIII, que es analizada en algunos casos, sobre todo para diferenciar entre secuencias de ADNmt que son idénticas para HVSI y HVSII (Lutz et al., 2000). Dentro de estas regiones, la tasa de mutación no es constante, habiendo sitios con una mayor tasa de cambio que otros (Meyer et al., 1999). En cuanto a los polimorfismos que encontramos en la región control del ADNmt, se pueden clasificar en dos tipos: de secuencia y de longitud.

Los polimorfismos de secuencia se refieren a mutaciones puntuales, es decir, mutaciones de un único nucleótido, y éstas a su vez pueden ser transiciones o transversiones. La mayoría de los polimorfismos de secuencia se encuentra dentro de la región control y las transiciones son el tipo de sustitución predominante. Por otra parte, los polimorfismos de longitud, hacen referencia a la variación en longitud de los tractos homopoliméricos dentro de la región control, debida a inserciones o deleciones de una o más bases, generalmente de citosinas.

Aunque el ADNmt constituye menos del 1% del ADN celular total, existe en un gran número de copias por célula. Cada célula humana contiene cientos de mitocondrias y miles de moléculas de ADNmt, en número variable según la especie, tipo celular, necesidades metabólicas y momento funcional del tejido.

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La función de las mitocondrias es puramente energética. Estas organelas se encargan de la producción de energía necesaria para los procesos biológicos del organismo, quemando las calorías de la dieta con el oxígeno respirado, para generar energía química. A su vez, generan el calor necesario para mantener la temperatura corporal. Sin embargo, para entender mejor su función e implicaciones en el ser humano, nos tenemos que remontar primero a sus orígenes, hace unos mil millones de años.

15.1. ADN mitocondrial en el ámbito forense.

Prácticamente cualquier vestigio biológico es susceptible de ser sometido a estudio de ADNmit. Incluso aquellos considerados no aptos para la obtención de ADN nuclear, como los tallos de pelo donde no se encuentran células completas pero que pueden conservar un número suficiente de mitocondrias imbuidas en la matriz de colágeno; o en tejidos como el óseo, donde la cantidad y calidad de ADN nuclear recuperado puede ser insuficiente para obtener el perfil genético. El hecho de estar presente en gran número de copias por célula, su pequeño tamaño y su conformación circular confiere al ADNmt protección y resistencia frente a los procesos de degradación ligados a la putrefacción. Allí donde sólo contamos con una copia completa de ADN nuclear tendremos de 100 a 10.000 copias de ADNmt, lo que indudablemente aumenta las probabilidades de que seamos capaces de obtenerlo en cantidad y calidad suficiente para su estudio.

Frente a estas ventajas no se han de olvidar los problemas que también presenta esta técnica. Por un lado el ADNmt no permite la identificación de individuos, sino de líneas familiares maternas; lo que en algunos casos supone más una ventaja que un inconveniente, como en la identificación de cadáveres, ya que nos permite utilizar muestras de familiares no directos que compartan un antecesor común por vía materna con el cadáver a identificar. Por otro lado, el peligro de contaminación de la muestra con ADN exógeno a la misma es grande, debido al alto número de moléculas presentes por célula, por lo que se deben extremar las precauciones en la manipulación de los vestigios biológicos tanto fuera como dentro del laboratorio

Agentes tales como la temperatura, la humedad y los compuestos químicos y productos biológicos presentes en el medio pueden acelerar de forma drástica los procesos naturales de descomposición celular y de degradación del ADN presente, tanto nuclear como mitocondrial. Algunos de estos agentes pueden incluso afectar nuestros estudios no porque destruyan el ADN, sino actuando como inhibidores en alguno de los procesos seguidos en el laboratorio, imposibilitando la obtención del perfil genético de ADN nuclear o de la secuencia de ADNmt del vestigio objeto de estudio, aun teniendo ADN suficiente para tal fin. Por ejemplo, los tintes de las prendas de vestir interfieren tanto con uno de los reactivos (la polimerasa) que impiden el desarrollo normal de la amplificación del ADN.

La aplicación de técnicas moleculares para estudiar los polimorfismos de ADNmt encuentra su justificación en lo siguiente:

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En la identificación de restos biológicos y el establecimiento de una relación familiar cuando no se dispone de los progenitores y no queda más remedio que realizar una comparación con familiares más lejanos. Si se trata de familiares vía materna tendrán exactamente el mismo ADN mitocondrial aunque se trate de familiares lejanos. Un estudio de ADN nuclear en estos casos sería poco informativo ya que cuanto más alejada sea su relación familiar menos alelos compartirán.

Cuando existe un sospechoso en un hecho delictivo pero no se dispone de muestra indubitada (restos biológicos de procedencia conocida) del mismo, se puede recurrir al estudio de ADN mitocondrial de un familiar relacionado matrilinealmente para excluirlo.

15.2. Procedimiento analítico

Las primeras etapas del análisis de ADNmt son comunes con las del ADN nuclear (obtención de la muestra a partir del vestigio, extracción y cuantificación). En estas fases hay que insistir en que se precisa de un buen método de extracción de ADN ajustado al tipo de tejido celular presente en la muestra. Los procedimientos utilizados para obtener ADN, tanto mitocondrial como nuclear, no son iguales cuando tratamos un hueso, un pelo, o una muestra de sangre, por ejemplo. Las características específicas de cada tejido deben ser tenidas en cuenta a la hora de intentar recuperar células de la matriz calcárea de un hueso, o mitocondrias de la matriz de colágeno de un tallo de pelo, ambos casos más complicados que la recuperación de células de una gota o de una mancha de sangre.

Una vez obtenido el ADN en cantidad y calidad suficiente se somete a un proceso de amplificación mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual nos permite realizar estudios a partir de pequeñas cantidades de ADN recuperado del vestigio biológico. En el análisis de ADNmt esta PCR nos sirve para aumentar el número de copias de aquellas regiones que nos interesan: las hipervariables HV1 y HV2, que como norma general, se estudian entre los nucleótidos 16.023 al 16.360 para la HV1 y entre los nucleótidos 73 al 340 para la HV2.

Uno de los principales problemas de la detección fluorescente es que existe solapamiento en los espectros de emisión de fluorescencia de los cuatro fluorocromos, lo cual se traduce en la posibilidad de causar errores en la asignación de bases. Por ello, actualmente se están desarrollando nuevos fluorocromos (rodaminados, dicloro-rodaminados, ―Big-Dye‖) que dan mejor resolución espectral. Con ello se quiere conseguir menor ruido de fondo, una señal de fluorescencia más limpia, una mejora en la asignación de bases y una mayor sensibilidad que permita reacciones en menor volumen, con menor número de ciclos y con menor cantidad de ADN molde necesario. (Prieto Solla, 2002). Sin embargo, no sólo es necesario un número alto de copias para poder leer estas secuencias, sino que las copias deben estar marcadas de algún modo que nos permita visualizarlas. Para ello los productos obtenidos en la PCR deben someterse a una segunda reacción de marcado en la que añadimos cuatro colorantes: uno por cada tipo de base nucleotídica (Adenina, Timina, Citosina y Guanina) cuya unión siguiendo un patrón determinado conforman las secuencias de ADN. La secuencia completa del ADNmt fue publicada por 14

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investigadores de Cambridge (Anderson y col.) en 1981, y desde entonces es utilizada en todos los estudios, tanto en el ámbito forense como en el ámbito de la antropología, como ―secuencia de referencia‖, de ahí el nombre con el que se la conoce, también llamada ―secuencia de Anderson‖ o ―Cambridge Reference Sequence‖ (CRS).

El análisis de los polimorfismos de secuencia de las regiones hipervariables (HV1 y HV2) del ADN mitocondrial (ADNmt.) mediante técnicas de secuenciación automática es una herramienta complementaria utilizada en la identificación humana y víctimas de catástrofes. Debido a su herencia exclusivamente materna, todos los miembros de una familia que compartan la misma línea materna tendrán el mismo haplotipo de ADN mt y, por tanto, aquellos podrán utilizarse en análisis genéticos comparativos. Además, el ADN mt se encuentra en un alto número de copias por célula (aproximadamente 500 copias de ADN mt por cada copia de genoma nuclear), lo que permite su aplicación en muestras con escaso o nulo contenido en ADN nuclear, el ADN mt permite identificar linajes maternos (Vallejo & Alonso, 2009).

Por convención, una vez realizada la secuenciación de las regiones HVI y HVII de las muestras de interés, estas son alineadas y comparadas con una secuencia de referencia, la secuencia de referencia de Anderson, también llamada Secuencia de Referencia de Cambridge y se reporta el conjunto de cambios entre las muestras estudiadas y la secuencia de referencia.

Finalmente las técnicas de secuenciación automática facilitan enormemente la lectura de secuencias genéticas, utilizando para ello unos colorantes especiales denominados ―fluorocromos‖, con la capacidad de ser excitados por la luz polarizada de un láser y de emitir fluorescencia en ciertas longitudes de onda. Estas longitudes de onda son captadas por una cámara especial encargada de enviar los datos recogidos a un ordenador, donde se almacenan para su posterior análisis. Los datos obtenidos a partir de la fluorescencia son analizados y traducidos a secuencias utilizando para ello un software específico. (Cano Fernandez et al., 2006)

Por lo mencionado el presente trabajo pretende responder a la siguiente pregunta de investigación: ¿pueden obtenerse simultáneamente perfiles completos de marcadores moleculares STRs autosómicos, STRs cromosoma – Y y ADN mitocondrial, a partir de manchas de sangre antiguas?