Los STRs son marcadores genéticos preferidos debido a que tiene un genoma abundante, es altamente variable en varias poblaciones ,su tamaño es pequeño ,facilita el desarrollo multiplex para PCR, permite el uso de pequeñas cantidades que son compatibles con ADN degradado.(Butler ,2006) Los STRs son regiones de ADN repetitivo que se encuentran distribuidas a lo largo del genoma, existiendo un microsatélite por cada 5.000-10.000 pb (Beckman y Weber 1992) y están compuestos por una secuencia de 1-7 pb que se repite en tándem desde 3 a 50 veces aproximadamente (Butler 2005).
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Figura 16.Esquema de STRs Fuente: Extraído de http//www.acercaciencia.com.
El estudio de un conjunto de marcadores STRs autosómicos, que son regiones cortas de ADN repetitivo nuclear que están distribuidas en los 22 cromosomas autosómicos humanos y no son ligados al sexo y que presentan una alta variabilidad de tamaño entre los individuos de la población y se heredan de forma mendeliana (es decir, se trasmiten de forma independiente al 50% por cada uno de los progenitores), este ADN conforma la mayor parte del ADN nuclear es único para cada persona excepto para los gemelos univitelinos y tiene un alto poder de identificación (mayor al 99.9999%) y sirve para hacer estudios de paternidad y maternidad y otros estudios(Lorente J.A.2007).
13.1. Tipos de STRs
Las secuencias de STRs pueden variar en el tamaño de la unidad de repetición, en el número de veces que se repite las unidades de repetición y en las características del patrón de repetición, según el número de nucleótidos que forman la unidad de repetición, los STRs pueden ser mono, di-, tri-, tetra-, penta- y hexanucleótidos .En cuanto al patrón de repetición los STRs pueden clasificarse en 4 categorías
- Repeticiones simples, con unidades de repetición idénticas en longitud y secuencia. - Repeticiones compuestas, constan de unidades con la misma longitud pero de secuencias diferentes.
- Repeticiones complejas, que pueden contener varios bloques de repeticiones de longitud variable además de secuencias variables intermedias.
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- Repeticiones hipervariables complejas, las cuales poseen numerosos alelos que difieren tanto en tamaño como en secuencia y por lo tanto ofrecen grandes dificultades en cuanto a la nomenclatura y a la reproducibilidad del genotipado entre diferentes laboratorios.
Tasa de mutación las tasas de mutación de los loci STRs son elevadas, desde 10-2 a 10-6 mutaciones por locus por generación, ayudan a la genética forense debido a su abundancia en el genoma humano, su naturaleza polimórfica, su relativo pequeño tamaño (100-400 pb) y que es posible el estudio simultáneo de varios STRs en un único análisis, los STRs autosómicos se convirtieron en unos marcadores ideales para la identificación individual en genética forense. Las dos grandes áreas de aplicación de los polimorfismos STR en este sentido son la investigación de vestigios biológicos de interés criminal y la investigación biológica de la paternidad.
Actualmente, los loci STR son más informativos para pruebas de identidad. Para mejorar el éxito en STR tipificación de ADN degradado, los cebadores de PCR para el STR. Los loci se pueden reposicionar para que residan más cerca de la repetición. (Budowle, Bieber, & Arthur, Forensic aspects of mass disasters: Strategic considerations for DNA-based human identification, 2005).
Los marcadores STR fueron primeramente descritos como herramientas para la identificación humana a principios de los años 90. En el Reino Unido el Forensic Science Service (FSS) desarrolló el primer sistema de STRs diseñado para el análisis forense, el cual consistía en la amplificación en la misma reacción de cuatro loci STR (TH01, VWA, FES/FPS, y F13A1. Seguidamente, una segunda generación multiplex (SGM) fue desarrollada con los loci TH01, VWA, FGA, D8S1179, D18S51 y D21S11 (Kimpton et al. 1996). En Reino Unido, el laboratorio del FBI estableció, en 1997, un núcleo de 13 loci STR que formarían la base del CODIS (Combined DNA Index System), la base de datos de los Estados Unidos (Budowle et al. 1998). Desde entonces, fueron apareciendo nuevos kits, que incluyen los 13 loci STR del CODIS y hoy en dia otros marcadores que incrementan el poder de discriminación.
Criterios de selección de los STRs para la identificación humana a la hora de seleccionar los loci STRs más adecuados para aplicaciones identificativas se deben valorar una serie de criterios: elevado poder de discriminación y heterocigosidad para valorar la aplicación de un marcador en genética forense se debe tener en cuenta su poder de discriminación y heterocigosidad.
Cuantos mayores sean estos valores mayor será la capacidad de dicho marcador para la identificación individual, meta clave en esta disciplina.
Baja tasa de mutación en situaciones donde se compara la evidencia con el perfil de un sospechoso, la tasa de mutación no es tan importante puesto que las mutaciones ocurridas en la línea germinal son mantenidas a lo largo de toda la vida (Butler 2006). Sin embargo, las tasas de mutación pueden jugar un papel importante en el diagnóstico de parentesco, ya que las relaciones parentales se realizan bajo la asunción de que los alelos se mantienen
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estables en su paso de generación en generación, por lo que la presencia de mutaciones puede provocar falsas exclusiones.
Tamaño reducido por lo general, las evidencias obtenidas en los casos de criminalística suelen contener leves trazas de ADN o ADN altamente degradado. En estos casos, el análisis mediante fragmentos de tamaño reducido presenta una mayor eficacia. Los STRs son mejores candidatos ya que su tamaño es menor, y en efecto son la herramienta más utilizada en el análisis de ADN de muestras forenses
Por otro lado, la importancia de los estudios genético poblacionales basados en el análisis de STRs autosómicos queda demostrada, tal y como se ha comentado en el apartado anterior, con la generación y ampliación de bases de datos poblacionales con fines forenses Los STRs autosómicos son marcadores de elección en las grandes catástrofes y evidencias biológicas antiguas debido a: su alto grado de polimorfismo genético, su pequeño tamaño que los hace susceptibles de ser analizados con muy alta sensibilidad mediante PCR, incluso en muestras con bajo contenido y ADN degradado), la posibilidad de realizar un análisis simultáneo de un gran número de regiones STR (multiplex-PCR) y la existencia de sistemas electroforéticos de alta resolución que permiten una determinación muy fiable de las variantes alélicas(Hernández R. 2014) .
Hoy día con los kits comerciales de multiplex-PCR se estudian simultáneamente 23 STR autosómicos más la amelogenina (marcador del sexo); son sistemas altamente validados en los laboratorios de genética forense de todo el mundo. Para ciertos casos (p. ej., paternidades defectivas), sin embargo, será necesario tener validados otros marcadores STR autosómicos complementarios o alternativos para aumentar el poder de discriminación. En ocasiones, las muestras obtenidas de las catástrofes o indicios como ser manchas hemáticas antiguas están afectadas de forma severa por la degradación, por tanto su ADN se encontrará muy dañado, y sólo se recuperan fragmentos de pequeño tamaño (< 150-200 pares de bases). (Hernandez , 2014).
Los genotipos STR compuestos se recopilan como códigos de números repetidos ("perfiles de ADN") (Kayser, 2007).
13.2. Análisis de STRs con electroforesis capilar
La técnica consiste en amplificar por PCR la región de interés, empleando primers marcados con fluorocromos, usualmente en reacciones multiplex, es decir, de varios sistemas genéticos a la vez, los kits comerciales mayormente empleados hoy en día, amplifican varios sistemas tipo STR en una sola reacción, se debe de realizar una PCR múltiple, la cual consiste en combinar en una sola reacción todos los pares de imprimadores de las regiones que queremos amplificar simultáneamente junto con el resto de reactivos de la reacción en cantidades suficientes(Lorente et al, 2007).
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Dentro de las ventajas que presenta: Obtención de la información de varios loci en una sola reacción, menor cantidad de templado en el análisis, disminución del tiempo de análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de una base de datos
Diferentes laboratorios han desarrollado kits basados en el análisis de STRs con marcadores fluorescentes los cuales tienen un alto poder de discriminación para la identificación humana, un ejemplo es el Kit comercial Identifiler™ (Applied Biosystems), con el cual se amplifican varios loci en la misma reacción, gracias al marcaje de uno de los imprimadores en el extremo 5`con fluorocromos (Martín, 2007).
Una vez obtenido el producto amplificado de las muestras de referencia, se realiza el montaje por electroforesis capilar en una plataforma automática, que excita los fluoroprimers de cada muestra cuando esta pasa a través de un laser. Donde cada uno de los colores representa un grupo de STRs marcados con diferentes colorantes fluorescentes: azul para los STRs marcados con el fluorocromo 6-FAM (5- carboxifluoresceína); verde para el VIC; amarillo para el NED; rojo para PET. En el proceso se separan los colores en diferentes componentes espectrales, cada uno de estos colores fluorescentes emite su máxima fluorescencia a diferente longitud de onda (Lorente et al, 2007).
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Los resultados son leídos como picos en un electroferograma, cada pico corresponde a un determinado alelo en la muestra, esto es al número de repeticiones que porta cada cromosoma.
La información recogida durante la electroforesis es procesada por el software obteniendo un electroferograma un patrón de picos que contiene la información necesaria para la construcción del perfil genético cada grupo de picos corresponde a un loci el alelo asociado a cada pico es determinado por el contiene software que contiene información acerca de las diferentes longitudes que puede presentar un loci y la altura del pico será proporcional a la cantidad de ADN. (Castro del Barrio, 2016)
1pico= El individuo es homocigoto en ese alelo
2 picos=El individuo es heterocigoto en ese alelo
3 picos =Posible mezcla o contaminación de prueba