What is a scientific model?

La tècnica de western-blot permet detectar la proteïna a estudi en els diferents extractes de proteïna resolts mitjançant SDS-PAGE, utilitzant anticossos específicament dirigits contra ella. Per fer-ho, es transfereix la proteïna del gel a membranes de PVDF. La membrana es deixa llavors

reaccionar amb l'anticòs primari (apartat 5.3.1.). La posterior incubació de la membrana amb anticossos secundaris anti-IgG acoblats a la peroxidasa de rave permet la detecció quimiluminiscent de la proteïna a estudi.

7.- Recuperar el gel i rentar en solució de transferència uns 10 min. Descartar el gel apilador amb ajuda d'un bisturí.

8.- Submergir en metanol absolut durant 10 seg un fragment de membrana de PVDF de grandària igual al gel separador. Eliminar el metanol sobrant rentant amb aigua durant 5 min i finalment mantenir-la en solució de transferència fins que l'equip estigui ensamblat. Aquests passos es fan en una placa de Petri, mantenint agitació constant.

9.- Realitzar la transferència utilitzant el sistema de BioRad Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell. El sistema consta d'un casset on es manté la membrana íntimament en contacte amb el

gel recobrint el conjunt per ambdós costats amb 3 fulles de paper Whatmann 3MM i una esponja. Una armadura dissenyada a aquest efecte manté fins a dos d'aquets cassets entre elèctrodes paral·lels, que seran els que promouran la transferència. Aquesta armadura s'encaixa en una cubeta, on s'afegirà una peça de gel que evitarà l'excessiva pujada de temperatura que té lloc durant el procés de transferència com a conseqüència dels voltatges aplicats. A l'hora de posar en contacte el

gel i la membrana s'ha d'evitar, en tant que sigui, possible la formació de bombolles d'aire que interfereixin en el procés de transferència de les proteïnes, o eliminar les que s'haguessin generat valent-se per a això d'una pipeta.

10. -El procés de transferència es perllonga durant almenys 1 hora (en el cas de gels de 1,5 mm d'espessor mitja hora més) aplicant un voltatge constant de 100 V. Per a mantenir la temperatura del sistema homogènia es manté la solució de transferència en constant agitació tot el

procés, a més de portar-se a terme a 4 oC .

Material i mètodes

11.- Transcorregut aquest temps es recupera la membrana. Un tall en una cantonada serveix d'ajuda per a orientar posteriorment la cara de la membrana que ha estat en contacte amb el gel durant la transferència i poder identificar així les bandes detectades.

12.- Realitzar un rentat de 5-10 min amb PBS 1x pH=7,6 amb l'objecte d'eliminar restes

d’acrilamida que puguin haver quedat adherits a la membrana.

13.- Rentar la membrana amb solució de Zeller dues vegades durant 5 min. En aquest pas es persegueix el bloqueig dels possibles llocs d'unió inespecífics de l'anticòs primari a la membrana.

Encara que el protocol convencional refereix la utilització de llet en pols desnatada al 5 % i Tween 20 al 0,1 % (v/v) en PBS 1x, els resultats obtinguts amb la solució de Zeller van ser més satisfactoris.

14.- Incubar la membrana durant tota una nit a 4 oC amb la dilució adequada d'anticòs primari en solució de Zeller. Es van utilitzar les següents dilucions:

-Anti-CD1-623: 1/10000.

-Anti-CD1[26-8]: 1/1000.

15.- Rentar de nou la membrana amb solució de Zeller durant dos períodes de 5 minuts a

temperatura ambient.

16.- Incubar la membrana amb solució de Zeller contenint la dilució adequada d'anticòs

secundari. Es van utilitzar anticossos anti-IgG de conill units a la peroxidasa de rave a una dilució de 1/7500.

17.- Realitzar un últim rentat de la membrana amb solució de Zeller durant 5 min.

18.- Realitzar tres rentats amb PBS pH 7,6 de 5 min cadascun.

19.- Dur a terme un últim rentat en aigua uns altres 5 min.

20.- Pel procés de detecció incubar la membrana durant 5 min protegida de la llum en un volum suficient dels reactius del sistema de detecció (ECL+Plus), preparats segons les proporcions

descrites pel proveïdor. Transcorregut aquest temps, eliminar l'excés de reactiu amb l'ajuda de paper assecant.

Material i mètodes

21.- A continuació, visualitzar la quimiluminiscència amb l’aparell “LAS-3000 luminescent image analyser” (Fujifilm) a diferents temps (normalment entre uns pocs segons i 30 minuts com a màxim), fins a obtenir una resolució i contrast òptims de la imatge. Cal considerar que el substrat

quimiluminiscent de la peroxidasa present en la solució de detecció té una estabilitat de al voltant d’una hora. SOLUCIÓ de TRANSFERÈNCIA: Trizma Base...3 g Glicina...14 g Metanol (opcional)...200 ml H2O destil·lada q.s.p...1 l PBS 10x pH 7,6 Na2HPO4...0,8 M NaH2PO4...0,2 M NaCl...0,1 M SOLUCIÓ de ZELLER: Tris-HCl pH 7,3...100 mM MgCl2...100 mM Tween-20...0,5 % Tritó X-100...1 % BSA (Albúmina Sèrica Bovina)...1 % FCS (Sèrum Fetal Boví)...5 % Aliquotar i conservar a –20ºC.

Tinció de proteïnes

La tinció del gel i de la membrana resulta de gran ajuda a l'hora de visualitzar l'eficiència de la transferència, la integritat de la proteïna, així com la normalització en la càrrega entre els diferents

carrils. Dues són les solucions de tinció més comunament usades. La primera, basada en el blau de Coomassie, resulta en una tinció més intensa, però té l'inconvenient de resultar irreversible. La segona, amb vermell Ponceau S, és més feble, però fàcilment eliminable amb aigua.

1.-Col·locar la membrana en solució de tinció (solució de Coomassie o solució de Ponceau S) durant 5-10 min a temperatura ambient i amb agitació.

Material i mètodes

2.-Destenyir la membrana en aigua durant uns min (per a solució de vermell Ponceau S) o en solució de destinció (solució de blau de Coomassie), reemplaçant el líquid de rentat corresponent quantes vegades sigui necessari fins que la relació entre la intensitat de les bandes i el soroll de fons

resulti òptima.

3.-Perllongant el rentat amb aigua de les membranes tenyides amb vermell de Ponceau S s'aconsegueix eliminar el colorant lligat a la proteïna, el que haurà de considerar-se si es desitja fotografiar la membrana.

SOLUCIÓ de PONCEAU S:

Vermell Ponceau S...0,5 g Àcid acètic glacial...1 ml H2O destilada q.s.p...100 ml

SOLUCIÓ de COOMASSIE:

Blau brillant de Coomassie...0,6 % Metanol...100 ml Àcid acètic glacial...25 ml H2O destilada q.s.p...250 ml

SOLUCIÓ de DESTINCIÓ:

Àcid acètic glacial...10 %

Metanol...40 %

Regeneració de la membrana

Després de la detecció, la membrana pot sotmetre's a un procés de rentat del sèrum unit a fi de repetir la inmunodetecció en diferents condicions o utilitzant altres anticossos. El següent procediment permet portar a terme, de manera senzilla, aquest propòsit:

1.-Incubar la membrana en un tub d'hibridació amb solució S durant 30 min a 50ºC. Es pot utilitzar un forn d'hibridació giratori.

2.- Recuperar la membrana i rentar durant 2 etapes d'uns 10 min en abundant PBS 1x a pH=7,6.

Material i mètodes

3- Finalment continuar amb el procés d’immunodetecció descrit pel pas 13 .

SOLUCIÓ S

Tris-HCl pH=6,7...62,5 mM -mercaptoetanol...100 mM SDS...2 % Preparar en el moment de fer-la servir.