Experiments

Se ha determinado capacidad de reducción del CO2 y del N2 en muchos representantes de este grupo de procariotas anaerobios, la mayoría en ambientes acuáticos o barros y sedimentos ricos en sulfuros. Pertenecen al orden Rhodospirillales y pueden realizar metabolismo fotolito o fotoorganotrofo. Las bacterias purpúreas no sulfurosas (Rhodospirillaceae) fotoasimilan sustancias orgánicas simples, muchas son incapaces de crecer con sulfuros como único donador de electrones, y si lo emplean no se acumula Sº en la célula. Rhodospirillum rubrum es una especie en la que se efectuaron numerosos estudios sobre su nitrogenasa.

Las bacterias sulfurosas purpúreas (Chromatiaceae) y las sulfurosas verdes (Chlorobiaceae) crecen con S= o Sº como únicos donadores externos de electrones. El Sº en la célula puede ser luego oxidado a sulfatos. La fotosíntesis de estos organismos es anoxigénica (no liberan O2) y la fijación del N2 se realiza en anaerobiosis a la luz (capítulo 2, tomo I).

Pueden desarrollarse en la oscuridad heterotróficamente, pero entonces son incapaces de fijar N2. Aunque no han sido estudiadas todas las especies de bacterias fotosintéticas por su capacidad de fijar nitrógeno, existe consenso de que la mayoría de ellas están dotadas de esta capacidad.

Pocas referencias se encuentran sobre su rol en ecosistemas agrícolas, en parte porque muchos trabajos evalúan la fijación en suelos y aguas sin detallar las especies responsables. Es reconocido que las bacterias fotosintéticas contribuyen a la depuración de suelos y aguas al consumir los sulfuros y aminas que perjudican a los cultivos, liberando además uracilo y prolina, empleados por muchos cultivos, entre ellos el arroz.

Cianobacterias

Este grupo posee todas las características subcelulares de los procariotas, excepto el tipo de fotosíntesis, que es la de las algas y vegetales. Son capaces de desarrollarse en medio mineral y obtienen su C y N de la fijación fotosintética del CO2 y N2. Con la obtención de cultivos libres de contaminantes bacterianos (muchas veces los responsables de la fijación) por radiación U.V. o agregado de antibióticos o colorantes en los medios de cultivo, el número de especies fijadoras se incrementó rápidamente: de aproximadamente 165 géneros, en 8 familias y 3 órdenes, se encontró fijación en 23 géneros, de 6 familias y 2 órdenes (cuadro 5).

Las cianobacterias presentan tres tipos de células: vegetativas, esporas o acinetos y heterocistos. Una célula vegetativa puede diferenciarse en esporas y heterocistos y todas poseen la información genética para la síntesis de la nitrogenasa, que como vimos es muy sensible al O2.

Los heterocistos son células rodeadas de gruesas paredes y parecen vacías al microscopio de luz. Son en general de mayor tamaño que las células vegetativas y están ubicadas a intervalos a lo largo del filamento o pueden presentarse terminalmente (figura 4 de Stewart, 1974). Presentan sistemas membranosos muy desarrollados con invaginaciones. Poseen abundantes ribosomas y han perdido los gránulos estructurales de glicógeno y polifosfato. Están conectados a células adyacentes por un poro en la pared celular.

Según algunos autores se originan en células preexistentes llamadas preheterocistos ubicadas a intervalos regulares del filamento, de tamaño algo mayor que el resto de la célula y según las condiciones ambientales pueden formarse los heterocistos. Otros autores opinan que la posición de ellos está determinada por los ya preexistentes, originándose nuevos cuando algunas sustancias, como el amonio fijado en los heterocistos, alcanzan niveles muy bajos. Su desarrollo es inhibido por niveles elevados de nitrógeno combinado.

Fijación en relación al O2

Aerobiosis: las cianobacterias filamentosas heterocísticas (Anabaena, Nostoc) pueden fijar N2 en estas condiciones ya que los heterocistos poseen activo fotosistema I, pueden fotofosforilar, pero no liberan O2 ni reducen el CO2. Poseen alta actividad reductora, recibiendo los compuestos carbonados, el ATP y el poder reductor de células adyacentes a las cuales les brindan el nitrógeno combinado resultante de la fijación. El sistema membranoso ofrece una protección estructural subcelular y la fotorrespiración activa remueve excesos de O2 (protección fisiológica).

Cuadro 5 - Fijación de nitrógeno en cianobacterias

Orden suborden familia Género (Nº spp fijadoras) características

Chroococcales

(35 géneros)

Chroococcaceae Gleocapsa (1) unicelulares

Oscilatoriales (unos 100 géneros) Nostocales Nostocaceae Oscillatoriaceae Nostocaceae Trichodesmiun (1) Oscillatoria (1) Plectonema (1) Lynbgbya (1) Phormidium (1) Anabaena (12) Anabaenopsis (1) Aulosira (1) Cylindrospermun (4) Nostoc (8) Nodularia (1) filamentosas con heterocistos Filamentosas Con heterocistos Rivulariaceae Scytonemataceae Calothrix (5) Scytonema (2) Tolypothrix Stigonematales Stigonemataceae Mastigociadaceae Fischerella (2) Hapalosiphon (1) Stigonema (1) Westielipsis (1) Mastigociadus (1)

Microaerofilia, las cianobacterias filamentosas sin heterocistos como Plectonema pueden fijar N2, pero no en condiciones de intensa oxigenación. Lo mismo ocurre en las unicelulares, como

Gloecapsa, aunque éstas pueden fijar N2 en el aire, existiendo una separación temporal entre la

liberación fotosintética del O2 y la actividad nitrogenásica.

Anaerobiosis es posible que tanto los heterocistos como las células vegetativas fijen N2. Las cianobacterias fijadoras liberan al medio una fracción del nitrógeno fijado, como amonio, amidas, péptidos, polipéptidos, que pueden representar un 20-30% del nitrógeno fijado. El cuadro 6 (resumido a partir de Mague, 1977) presenta algunos datos sobre aportes de nitrógeno por estos organismos en distintos lugares del mundo.

Las cianobacterias son responsables del nitrógeno fijado en áreas marinas, en mayor medida por las heterocísticas. Las que no poseen estas células especializadas fijan N2 en zonas de bajo nivel de O2, aguas estancadas y eutrofizadas, de importancia en algunos ecosistemas.

Asociaciones con cianobacterias

Estos diazotrofos fotosintéticos se asocian con hongos, hepáticas, helechos, gimnospermas y angiospermas. Lo hacen con los representantes más primitivos entre los vegetales, mientras que

Rhizobium y Frankia lo hacen con vegetales superiores: angiospermas dicotiledóneas.

Azolla-Anabaena

Muy estudiada es la simbiosis Azolla-Anabaena. La Azolla es un diminuto helecho de agua que se desarrolla en zonas tropicales en donde llega a cubrir enormes extensiones de arrozales inundados. Mide sólo 2-3 mm de ancho y alberga a una cianobacteria del género Anabaena en poros ventrales de los lóbulos de las hojas (figura 4), muy rica en heterocistos. La planta le ofrece una protección adicional frente al O2 liberado en la fotosíntesis propia y la de la planta. Azolla filiculoides está profusamente colonizada por Anabaena azollae en Río Cuarto, Argentina (Frioni, 1983). La cianobacteria no crece bien fuera del huésped.

Las características de esta asociación y su empleo desde la antigüedad como biofertilizante

(azollización) han sido reseñados por Lumpkin, 1987 y Silver y Schröder, (1984) : en épocas secas el helecho es mineralizado y el nitrógeno fijado se incorpora al suelo.

Líquenes

De las 17.000 especies conocidas, aproximadamente un 8% posee una cianobacteria fijadora:

(Peltigera canina, Peltigera aphtosa). Son muy estudiados por su contribución en nitrógeno en suelos

muy fríos y en bosques tropicales, donde especies de Stricta, Leptogium y Collema pueden contribuir con 1 a 8 kg N/ha/año.

Las cianobacterias filamentosas asociadas cambian su forma filamentosa simple por la de filamentos altamente contorneados, las células vegetativas se redondean y se dividen escasamente. Los heterocistos aumentan de un 3-5% al 20-60% en asociaciones con prototrofos, mientras que en asociaciones con heterótrofos, la frecuencia permanece baja.

Figura 4 - Cianobacterias y sus asociaciones con vegetales

A) Gloecapsa alpina, B) Anabaena acheremetievi, con heterocistos

C) Microcoleus chitonoplastes , filamentosa, D) Cortes de Azolla con filamentos de Anabaena, E)

Corte de rizoma de Gunnera, con Nostoc, F) Reproducción en líquen por liberación de hifas, G) Idem por liberación de ascosporas fúngicas

Las células en simbiosis presentan también más bajo contenido de gránulos de cianoficina que representan reservas de nitrógeno con ácido aspártico y arginina en relación 1/1 molar. Los gránulos de polifosfatos son abundantes en simbiosis. Las ficobiliproteínas constituyen reservas de nitrógeno, además de actuar como pigmentos accesorios en el fotosistema II.

La luz es necesaria para la fijación. Los líquenes toleran condiciones extremas: en regiones de Suecia y Noruega, la fijación ocurre a 0ºC y los organismos sobreviven a heladas prolongadas y a la sequedad, aunque no fijan N2 hasta que se rehumedecen. Constituyen la vegetación principal de ambientes extremos como piedras, zonas arenosas, facilitando luego la colonización por otros microorganismos. La cianobacteria posee escasa actividad de glutamino sintetasa, bloqueando parcialmente la ruta primaria de asimilación de NH3, que es liberado y transferido al hongo.

Otras asociaciones

En zona tropical se describe una asociación con una gimnosperma, la Cycadaceae, donde especies

de Nostoc forman estructuras parecidas a nódulos en las raíces (figura 4). Aproximadamente un tercio

de las 90 especies poseen estos nódulos, con aportes de unos 19 kg N/ha/año en Macrozamia riedlei

(Stewart et al, 1979). Entre las angiospermas sólo se conoce un representante subtropical, Gunnera,

que se asocia a Nostoc heterocística fijadora en glándulas de la base de las hojas. El nitrógeno fijado es rápidamente transferido al eucariote, sobre todo como amonio.

Cuadro 6- Rangos de fijación de nitrógeno por cianobacterias

habitat género dominante en la FBN N fijado aguas termales Mastigocladus, Calothrix 22 ugN/mgalgal/día costas marinas (Escocia) Calothrix 30 mgN/m2/día zona litoral (Noruega) Calothrix 11 “ “ dunas arenosas Nostoc 140 mgN/m2/hora Golfo de Méjico Calothrix 13 mgN/m2/hora océano abierto

Mar del Sargaso Trichodesmiun 4,7 ugN/mg algal/día Pacífico Norte Richelia en líquenes 13 mgN/m2/hora arrozales

Japón Tolypothix 2,2gN/m2/año India no detalladas 5,0gN/m2/6 semanas Filipinas no detalladas 5,5mgN/m2/día suelos

pastura (Escocia) no detalladas 1,5mgN/m2/día prados (Suecia) Nostoc, Anabaena 22 mgN/m2/día pasturas (Canadá) Nostoc 50µgN/gpeso fresco/dia zona árida (Australia) Nostoc, Anabaena 134µgN/m2/hora tundras (Alaska) Nostoc, Anabaena 15mgN/m2/año y líquenes

Empleo de las cianobacterias como biofertilizantes

Desde la década de los sesenta se informan en Japón resultados de inoculación en suelos inundados de arroz (cuadro 6). La contribución a la economía del nitrógeno en suelos de la zona templada no sería muy importante, pues son muy afectadas por la desecación.

Nostoc, Anabaena, mantienen su efecto estimulante luego de la esterilización, y se piensa que su

acción se debe a sustancias del tipo de las citoquininas, más que a auxinas y/o giberelinas, más termolábiles.

La práctica de la inoculación se va popularizando, los cultivos son fáciles de propagar en agua con sales minerales a la luz y su transporte se facilita si se mezclan con arena y se secan. Los productores comienzan a propagar sus inóculos en piletas vecinas a los cultivos de arroz. El cuadro 7 muestra a) el efecto de la inclusión de Azolla en el crecimiento y contenido de N en plantas de arroz, con y sin período seco en el cual el helecho se seca y muere y en b) la inoculación con Tolypothrix en el agua de riego en el mismo cultivo.

En la mayoría de los suelos agrícolas de zonas templadas, el aporte en N por cianobacterias no es muy alto, en parte por los requerimientos de luz y humedad. Además muchas veces la superficie de los suelos se deseca por largos períodos de tiempo. Una irrigación oportuna favorece la práctica de inoculación. Son muy empleadas en cultivos inundables, como es el caso del arroz.

Cuadro 7- Manejo del cultivo de arroz con Azolla (a) y Tolyothrix (b)

a) Arroz por maceta

tratamiento agua peso seco (g) N total(mg)

testigo continuo c/sequía 37 40 221 240 c/Azolla continuo c/sequía 43 49 316 465 b)

condición rendimiento % de incremento

suelo mal drenado testigo 45

suelo drenado testigo 30

inoculado 38 26