File Name Inserts

Como ya se ha descrito en esta memoria, las condiciones ecológicas que ofrecen los productos cárnicos madurados favorecen el desarrollo de una población fúngica superficial, que aunque puede contribuir a la maduración (Martín y col., 2004, 2006), también puede originar defectos o alteraciones (Sanz, 1986; Spotti y col., 1988) e incluso producir micotoxinas (Núñez y col., 1996, 2007; López-Díaz y col., 2001; Sabater-Vilar y col., 2003). Para controlar la población fúngica podrían utilizarse cultivos iniciadores que al implantarse en el producto fuesen capaces de inhibir por competición a los mohos no deseados. No obstante, la evolución de las condiciones ecológicas a lo largo de la maduración puede hacer que los cultivos terminen siendo desplazados por otras cepas mejor adaptadas. En cambio para los aislamientos de P. chrysogenum RP42C y AS51D, la producción de las proteínas PgAFP y PgChP con actividad antifúngica, puede suponer una ventaja adicional para competir frente al resto de mohos. De hecho, tanto PgAFP como PgChP se purificaron como resultado de la búsqueda de mohos productores de proteínas antifúngicas para su utilización como cultivos protectores en productos cárnicos madurados (Acosta, 2006). Además, ambas cepas han sido aisladas de jamón curado, por lo que se trata de mohos adaptados a las condiciones de temperatura, actividad de agua y pH que se dan a lo largo del proceso de maduración. Adicionalmente, P. chrysogenum ha sido propuesto como cultivo iniciador para la elaboración de productos madurados por su contribución a la formación de sabor y aroma en el producto acabado (Martín y col., 2004, 2006; Benito y col., 2005). Dado que P. chrysogenum RP42C produce proteína activa en condiciones similares a las de las etapas iniciales de la maduración (Acosta, 2006), será de gran interés confirmar la producción tanto de PgAFP como de PgChP en productos madurados. Además, el amplio espectro de inhibición mostrado fundamentalmente por P. chrysogenum RP42C frente a mohos toxigénicos de interés en estos productos, como A. flavus, A. parasiticus o P. commune, permite ser optimistas respecto a su utilización como cultivo protector para garantizar la seguridad alimentaria en este tipo de alimentos.

No obstante, también podrían emplearse ambas proteínas purificadas en productos en los que no sea deseable el desarrollo de mohos. Además PgChP, debido a su actividad quitosanasa, podría también emplearse para la producción de oligómeros de quitosán a nivel industrial.

De forma general y como paso previo a la aplicación de una proteína a nivel industrial, resulta de gran importancia garantizar que la actividad antifúngica se mantiene en presencia de determinados compuestos que puedan estar presentes en el producto donde se vaya a aplicar (Theis y Stahl, 2004). Adicionalmente el efecto de ciertos tratamientos a temperaturas o pHs extremos puede condicionar también sus posibles aplicaciones. Por otra parte, la posibilidad de incrementar la actividad de estas proteínas mediante la adición de determinados sustratos es otro factor a tener en cuenta antes de proponer futuras aplicaciones.

V. 5. 1. APLICACIÓN DE PgChP Y PgAFP COMO AGENTES ANTIFÚNGICOS

Como se ha comentado anteriormente, no sólo resulta de gran interés la posibilidad de utilizar mohos productores de proteínas antifúngicas como cultivos protectores en productos madurados, sino que también puede ser útil el uso de PgAFP y PgChP como aditivo en alimentos en los que no sea deseable el desarrollo del moho productor.

El uso de proteínas antimicrobianas como protectores en alimentos no es un concepto nuevo. Concretamente la nisina, bacteriocina producida por varias cepas de Lactococcus lactis, ha sido aprobada como GRAS (“Generally Regarded as Safe”) en ocho países de la Unión Europea. Esta proteína es ampliamente utilizada en productos lácteos, vegetales, carne o pescado (Delves-Broughton y col., 1996) para evitar el desarrollo de bacterias patógenas gram positivas como Bacillus cereus, Listeria monocytogenes o determinadas especies de Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus (Lubelski y col., 2008). Además, la nisina ha sido comercializada para el tratamiento de infecciones gástricas causadas por Helicobacter spp. y algunas de sus variantes están siendo probadas en ensayos clínicos para tratar enfermedades producidas por enterococos resistentes a la vancomicina (Reddy y col., 2004).

No obstante, antes de proponer a PgAFP y PgChP para su utilización como compuestos antifúngicos en alimentos se deben evaluar los posibles efectos indeseables que pudieran ocasionar en los consumidores para evitar cualquier peligro de tipo sanitario. Por otra parte, la estabilidad de las mismas tras el tratamiento a diferentes temperaturas y

pHs o en presencia de determinados compuestos que se encuentren en los sustratos donde se pretendan utilizar, condicionará en gran medida sus posibles aplicaciones.

Como se ha mencionado, tanto PgChP como PgAFP fueron inicialmente purificadas mediante cromatografía de intercambio catiónico (Acosta y col, 2009a) con el objeto de obtener proteínas con carácter básico, ya que esta característica está relacionada con una mayor actividad antifúngica y una menor toxicidad para las células de mamíferos (Hong y col., 2001). No obstante, si bien PgAFP mostró un pI de 9,2 (Acosta y col., 2009b), PgChP mostró un pI de 5 (Manuscrito 4, figura 6), lo que supone que esta proteína no es catiónica a pH fisiológico.

La ausencia de actividad hemolítica de PgChP y PgAFP frente a glóbulos rojos (Manuscritos 3 y 6), y en el caso de PgAFP también de toxicidad para larvas de Artemia salina (Manuscrito 3), permite ser optimistas hasta el momento con respecto a la inocuidad de estas proteínas, ya que estas técnicas son comúnmente empleadas para chequear la toxicidad de nuevas sustancias (Van’t Hof y col., 2001; Theis y Stahl, 2004; Milhem y col., 2008; Chohan, 2009).

La ausencia de efectos negativos podría permitir la utilización de PgAFP y PgChP en diversos campos de aplicación, si bien el presente estudio se ha enfocado hacia una posible aplicación en alimentos. Por ello, se evaluó el efecto sobre la actividad antifúngica tanto de diferentes tratamientos como de diversos compuestos comúnmente encontrados en alimentos, como sales, detergentes o fosfatos (Tabla V.3; Manuscritos 3 y 6).

Tabla V.3. Resistencia de PgAFP y PgChP a tratamientos térmicos, distintos pHs, cationes, fosfato sódico, quelantes y detergentes en las proteínas, expresada como los valores máximos a los que se mantiene actividad antifúngica.

D E:/ $ = E:/ $ F G ' HI 7 I I _G : I G > / / > 7 F G G J K GGG J = K GGG "$! @ G GGG' GGG L L & GGG M & ' 5$&14$& GGG GGG

a_{: Máxima concentración empleada 100 mM.} b_{: Máxima concentración empleada 1 mM.} c_{: Máxima concentración empleada 1 %.}

d_{---: Pérdida de la actividad antifúngica de la proteína.}

n.c.: Afectó al crecimiento del moho y su influencia no pudo determinarse. n.d.: No determinado.

Muchos productos alimentarios se someten de forma rutinaria a tratamientos térmicos, ya sea como consecuencia del propio proceso de elaboración o con el objeto de garantizar su estabilidad microbiológica, lo que condiciona en gran medida la aplicación de ambas proteínas. En este sentido, tanto PgChP como PgAFP mostraron actividad antifúngica incluso tras tratamientos térmicos a 80 y 100ºC, respectivamente.

Dado que concentraciones de Ca2+ _{de 10 a 100 mM pueden inhibir la actividad de}

estas proteínas, su uso se vería limitado en alimentos ricos en calcio como el queso. Si embargo, la actividad de PgAFP y PgChP se mantuvo en presencia de altas concentraciones de Na+ y K+, lo que puede ser de gran interés en productos cárnicos madurados, donde abunda el cloruro sódico y puede haber otras sales de sodio y potasio.

Además, estas proteínas muestran una mayor resistencia a estos iones que otras como PAF o AFP, cuya actividad ya se reduce en presencia de 40-60 mM de Na+ (Kaiserer y col., 2003) o Na+ y K+ (Theis y col., 2003), respectivamente.

Otras sustancias como el EDTA y los fosfatos se utilizan como aditivos, entre otras razones, por su capacidad de secuestrar metales en alimentos no ácidos que requieren aditivos sin sabor (Calvo, 1991). Si bien los quelantes no tuvieron un gran impacto en la actividad antifúngica de PgChP y PgAFP, ésta se redujo en presencia de una alta concentración (100 mM) de fosfato, aunque esta disminución, en el caso de PgAFP, depende de la concentración de la proteína y del moho sensible utilizado.

El uso de detergentes no iónicos como emulsionantes también está extendido en la industria alimentaria. De hecho, en España se emplean en confitería, repostería y para la elaboración de galletas (Calvo, 1991), si bien de los detergentes evaluados en este estudio sólo tween 20 y tween 80 están autorizados en alimentos (E-432 y E-433, respectivamente). Los detergentes inhibieron la actividad antifúngica de PgChP, pero PgAFP se mantuvo activa con un 1% de tween 20 o de tween 80. Dado que esta concentración supera los niveles habituales en los alimentos de 0,1-0,3% (R.D. 142/2002), la presencia de estos aditivos no afectaría a la actividad de PgAFP.

Además de la utilización de PgAFP y PgChP de forma individual, la combinación de ambas o con algún tratamiento físico o químico podría suponer un efecto sinérgico que incrementara la actividad antifúngica en los alimentos. Adicionalmente, aunque PgAFP haya mostrado un espectro de inhibición muy amplio (Acosta y col, 2009b), el uso combinado con PgChP podría ampliar la actividad a mohos que posean quitosán en la pared celular como Mucor o Rhizopus (Shimosaka y col., 2005; Somashekar y Joseph, 1996), géneros alterantes en productos cárnicos madurados.

Por otra parte, la estabilidad mostrada por ambas proteínas al tratamiento con temperaturas y pHs extremos abre un gran abanico de posibilidades respecto de su combinación con diferentes tratamientos físicos o químicos. La combinación de compuestos antimicrobianos con tratamientos térmicos, químicos o físicos como las altas presiones o los campos eléctricos pulsados, está siendo ampliamente estudiada. Así, la nisina ha sido combinada con lisozima y campos eléctricos pulsados (Sobrino-López y Martín-Belloso, 2008), con tratamientos de frío (Cao-Hoang y col., 2008), con calor y acidificación (Naim y col., 2008), o con ácido láctico y monolaurina (Tokarsky y Marshall,

2008) para controlar diversos patógenos en alimentos. Combinaciones similares no sólo pueden suponer un incremento en la actividad de PgAFP y PgChP, sino que también podrían modificar su especificidad. De hecho la proteína antifúngica cecropina B, que por sí sola no tiene efecto frente a E. coli, en combinación con lisozima es eficaz para combatir este microorganismo (Casteels y col., 1993).

Por todo lo anterior, PgChP y PgAFP parecen tener características idóneas para ser empleadas como agentes protectores en diversos alimentos que requieran un control frente a mohos alterantes o toxigénicos. No es previsible que la utilización de estas proteínas como aditivo provoque alteraciones en la flora intestinal beneficiosa del consumidor ya que ambas poseen un mecanismo de acción específico frente a mohos. Por otra parte, estudios realizados con PgAFP muestran la sensibilidad de esta proteína a tripsina, pepsina y lisozima (Acosta, 2006), por lo que podría ser degradada en el tracto gastrointestinal.

No obstante, la aplicación de PgAFP y PgChP no tiene por qué estar limitada a un uso en alimentos. De hecho se ha propuesto la utilización de proteínas antifúngicas similares en otros campos como la agricultura o en terapéutica humana (Marx y col., 2007; Meyer, 2008). En este sentido, la incorporación de genes que codifican proteínas antifúngicas ha permitido la obtención de cultivos transgénicos resistentes a plagas de hongos (Campo y col., 2008; Swathi-Anyradha y col., 2008) y ciertas proteínas antifúngicas están siendo ya estudiadas para su uso como agentes farmacológicos (Cappelletty y Eiselstein-McHitrick, 2007; Wiederhold y Lewis, 2007; Fortún y col., 2009).

V. 5. 2. APLICACIÓN DE PgChP COMO QUITOSANASA

Dado que la caracterización aminoacídica de PgChP reveló que pertenecía a la familia G-75 de quitosanasas, fue necesario comprobar su capacidad para hidrolizar quitosán. Aunque algunas quitosanasas pueden hidrolizar polisacáridos distintos al quitosán (Pelletier y Sygusch, 1990; Shimosaka y col., 1995; Kimoto y col., 2002), PgChP no presentó indicios de degradación de la quitina (Manuscrito 6), como suele ser habitual entre las quitosanasas (Fukamizo y Brzezinski, 1997; Su y col., 2006).

La quitina es el componente estructural mayoritario del exoesqueleto de invertebrados y de las paredes celulares fúngicas (Lower, 1984; Ornum, 1992). Debido a que la degradación de la quitina es muy lenta, la acumulación de desechos resultantes del procesado de crustáceos es un problema emergente en la industria de productos de la pesca

(Shahidi y Synowiecki, 1991). No obstante, estos desechos pueden ser empleados para la producción de sustancias muy beneficiosas a nivel industrial, como son la quitina, el quitosán, o los productos de la degradación de los mismos. De hecho, los oligómeros resultantes de la degradación del quitosán tienen múltiples aplicaciones: como inhibidores de la producción de micotoxinas (Cuero y col., 1991), purificadores de agua (Jeuniaux, 1986; Muzzarelli y col., 1989), neutralizantes de acidez en zumos de fruta y vino (Chen y Li, 1996; Rwan y Wu, 1996; Spagna y col., 1996), e incluso como agentes antitumorales y potenciadores del sistema inmune (Pae y col., 2001). Adicionalmente, y como resultado de la búsqueda de nuevos antimicrobianos naturales, los oligómeros del quitosán han mostrado actividad antimicrobiana frente a bacterias, levaduras y mohos (Yalpani y col., 1992).

El quitosán puede ser degradado mediante hidrólisis química o enzimática, obteniéndose oligómeros de menor (monómeros-trímeros) o mayor grado de polimerización (pentámeros-heptámeros), respectivamente. No obstante, los oligómeros resultantes de una hidrólisis enzimática con quitosanasas muestran mejores características funcionales (Kendra y Hadwiger, 1984; Uchida y col., 1988), lo que ha incrementado el interés por este tipo de enzimas.

Dado que las quitosanasas difieren en sus propiedades enzimáticas (Wang y col., 2008b), es necesario conocer el efecto sobre PgChP de diversos factores como iones o detergentes para potenciar su actividad.

Los iones Ca2+ y K+ no tuvieron efecto alguno sobre la actividad quitosanasa de PgChP a concentraciones de 100 mM, mientras que Mg2+ y Na+ sí influyeron en la actividad por encima de 10 mM. En el caso de los quelantes, aunque la actividad se redujo en presencia de una alta concentración (1 mM) de EDTA, con EGTA se llegó a triplicar la cantidad de glucosamina liberada (Manuscrito 6). La influencia de altas concentraciones de Mg2+ y Na+ sobre PgChP puede deberse a que los iones afecten a la estructura de la proteína impidiendo su actividad, tal y como ha sido descrito para otras quitosanasas de mohos (Wang y col., 2008b). De hecho, el tratamiento con SDS y ácido deoxicólico, detergentes iónicos con conocido efecto desnaturalizante, produjo una inhibición de la actividad de PgChP. Por el contrario los detergentes no iónicos, fundamentalmente el Tritón X-100, favorecieron la actividad de la proteína. De forma similar, en presencia de fosfato (10 mM) se duplicó la cantidad de glucosamina liberada.

En conclusión, la producción de oligómeros de quitosán mediante hidrólisis con PgChP puede incrementarse en presencia de EGTA, Tritón X-100 y fosfato, siendo las concentraciones más apropiadas 0,1 mM, 1 % y 10 mM, respectivamente. La proteína podría además ser empleada en presencia de altos niveles Ca2+ _{y K}+_.

No obstante, la actividad quitosanasa de PgChP debe ser evaluada a diferentes temperaturas y pHs con el fin de encontrar las condiciones óptimas para la degradación del quitosán.

VI. CONCLUSIONES

1. PgAFP es una nueva proteína antifúngica de 6,5 kDa, en la que no se han detectado glicosilaciones. De acuerdo con su secuencia primaria, pertenece a un grupo de proteínas antifúngicas de pequeño tamaño, básicas y con alto contenido en cisteína, que son producidas por mohos.

2. La proteína antifúngica PgChP presenta diversas isoformas glicosiladas con pesos moleculares comprendidos entre 30 y 31 kDa y, de acuerdo con su secuencia aminoacídica y su actividad enzimática, es una nueva quitosanasa perteneciente a la familia GH-75, mayoritariamente compuesta por quitosanasas fúngicas.

3. Las secuencias aminoacídicas deducidas de los genes que codifican estas dos proteínas revelan la existencia de un péptido señal en ambas y una prosecuencia en PgAFP que no están presentes en las proteínas purificadas.

4. La ausencia de actividad hemolítica y de toxicidad frente a larvas de Artemia salina, junto con la reconocida inocuidad de P. chrysogenum, permite plantear la aplicación de estas dos proteínas en alimentos.

5. Ambas proteínas antifúngicas muestran una gran estabilidad a tratamientos térmicos, y mantienen su actividad en presencia de quelantes o fosfato sódico a las concentraciones que pueden encontrarse en alimentos.

6. La actividad antifúngica de las dos proteínas sólo se ve limitada en presencia de altas concentraciones de iones divalentes o de detergentes iónicos, si bien los detergentes no iónicos afectan a la proteína PgChP. Por lo tanto, estas proteínas pueden ser de utilidad en un amplio rango de alimentos.

7. La actividad quitosanasa de PgChP es independiente de la actividad antifúngica y no se ve limitada por altas concentraciones de iones de calcio y detergentes no iónicos. 8. Las proteínas PgAFP y PgChP muestran características adecuadas para controlar el

VI. CONCLUSIONS

1. PgAFP is a novel antifungal protein of 6.5 kDa with no glycosylations. According to its primary sequence, it belongs to a group of small, basic, and cystein-rich antifungal proteins produced by moulds.

2. The antifungal protein PgChP has several glycosylated isoforms with molecular weights ranging from 30 to 31 kDa. According to primary sequence and enzymatic activity, it is a novel chitosanase belonging to the GH-75 family, mainly composed by fungal chitosanases.

3. The putative amino acid sequences reveal a signal peptide in both proteins and one prosequence in PgAFP that are not found in the purified proteins.

4. The lack of haemolytic activity and toxicity against Artemia salina larvaes together with the safety granted to P. chrysogenum support the potential application of these two proteins in foods.

5. Both antifungal proteins show a high thermal stability and keep their activity with chelators or sodium phosphate at the concentrations found in foods.

6. The antifungal activity of the two proteins is only restricted by high concentrations of divalent ions or ionic detergents, whereas non-ionic detergents only affect to PgChP. Therefore, these two proteins can be of use in a wide range of foods.

7. The chitosanase activity of PgChP is not related to the antifungal activity, and it is restricted by neither high calcium ion concentrations nor non-ionic detergents. 8. Both proteins show appropriate characteristics to control growth of unwanted moulds