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La caracterización a nivel bioquímico de PgChP y PgAFP reveló la existencia de grandes diferencias entre ellas, aún tratándose ambas de proteínas con actividad antifúngica producidas por P. chrysogenum. Así, en el caso de PgChP se trata de una glicoproteína aniónica de unos 30 kDa que en principio muestra escasas características comunes a PgAFP, de sólo 6,5 kDa y marcado carácter catiónico. El análisis de las secuencias tanto aminoacídica como genética y su posterior comparación en bases de datos permitió corroborar la existencia de tales diferencias. De hecho PgChP y PgAFP mostraron semejanzas con diversas proteínas producidas por mohos con actividad quitosanasa o antifúngica respectivamente.

PgChP reveló homologías tanto con quitosanasas fúngicas descritas como con secuencias deducidas del genoma de distintos mohos, aunque la mayor similitud se

encontró entre PgChP y siete quitosanasas fúngicas con los siguientes números de adquisición en Genbank: XP_754126 (Aspergillus fumigatus), XM_001262949 (N. fischeri), XM_001390407 (Aspergillus niger), BAD08218 (Aspergillus oryzae-1), XP_001824257 (A. oryzae-2), XM_001209034 (Aspergillus terreus) y XP_001274664 (Aspergillus clavatus). PgChP presentó cerca del 60% de homología con las siete proteínas, siendo la más parecida la quitosanasa CSN de A. fumigatus.

Las quitosanasas (E.C. 3.2.1.132) son glicosil hidrolasas (glicosidasas) que cortan enlaces glicosídicos del quitosán, y son producidas por virus, bacterias y hongos (Wang y col., 2008a, Wang y col., 2008b). En función de sus secuencias aminoacídicas se han clasificado en cinco familias: GH-5, GH-8, GH-46, GH-75 y GH-80. Las quitosanasas fúngicas están incluidas en la familia GH-75 (Cheng y col., 2005), compuesta principalmente por glicosidasas producidas por mohos de los géneros Aspergillus y Fusarium (Shimosaka y col., 1996; Cantarel y col., 2008).

Como era de esperar, la secuencia aminoacídica deducida del gen pgchp presentó numerosas regiones comunes con las siete proteínas que mostraron mayor homología (Manuscrito 5, figura 5), incluyendo tres regiones conservadas en quitosanasas muy relacionadas con su actividad y dos aminoácidos, glutámico y aspártico, esenciales para la función catalítica de este tipo de enzimas, tal como se ha descrito para la quitosanasa de F. solani (Shimosaka y col., 2005). De la misma manera, los diez residuos de cisteína presentes en PgChP están conservados en las siete quitosanasas del alineamiento, y probablemente confieren estabilidad mediante la formación de enlaces disulfuro (Nakaya y col., 1990; Marx y col., 1995; Lee y col., 1999).

Por otra parte, en la familia GH-75 existen varias hidrolasas producidas por bacterias del género Streptomyces. PgChP mostró una homología del 25% con quitosanasas deducidas de los genes de S. griseus y S. avermitilis. Dado que se ha descrito que las quitosanasas bacterianas y fúngicas tienen un origen evolutivo diferente (Zhang y col., 2000; Shimosaka y col., 2005), esa similitud se debería a la presencia de una serie de aminoácidos de gran importancia para la estructura y la actividad catalítica del enzima (Monzingo y col., 1996). De hecho los aminoácidos glutámico y aspártico, esenciales para la actividad de las quitosanasas fúngicas (Shimosaka y col., 2005), están presentes también en estas dos proteínas bacterianas (Figura V.3). Por el contrario, las tres secuencias altamente conservadas en quitosanasas fúngicas no parecen tener relación con las homólogas en las secuencias de las proteínas bacterianas (Figura V.3).

Figura V.3. Alineamiento de PgChP con otras quitosanasas fúngicas y bacterianas. Los aminoácidos sombreados son comunes a todas las quitosanasas del alineamiento. Las tres zonas altamente conservadas en quitosanasas fúngicas están englobadas en cuadros.

*: Residuos de ácido aspártico y glutámico esenciales para la función catalítica.

Números de adquisición de las proteínas: XP_001390407 (A. niger), BAD08218 (A. oryzae- 1), XP_001824257 (A. oryzae-2), XP_754126 (A. fumigatus), NP_823026 (S. avermitilis) y YP_001822750 (S. griseus).

PgChP --MMTYSRLIPFALFALFGTGLAQTVDGSKFNKPDGGPPGSYFAAGSSIPVAALQSAAAK

A.niger MAFKTTAGLA---FLALAGSVKAQSVDGSKYNSPSNGPPASYFAAATTLPVAALQSAAAK

A.oryzae-1 MPIKSFASRLALS-LAICGTAMGQKVNGADYNKPDGGPPAKFFQASSSIPVAAIQAAAAK

A.oryzae-2 MPIKSFASRLALS-LAICGTAMGQKVNGADYNKPDGGPPAKFFQASSSIPVAAIQAAAAK

A.fumigatus MPSTTIIRQLAIS-LALCNSALGQVVNGADYNKPNGGPPASFFAAASTMPVAALQAAAAK

S.avermitilis MRTRTLTLAAAAGAALLATAALPATASPSGTKAPASA---QEGS-VSAASLLAKVTS

S.griseus MRTRVLAL----TSAACCAALLGAAALPASATGPGAGQEPLAAEAGAPATAAELLAEVRA

PgChP ARTPVPDATYPINGDNGAKKVTIHSDWAKFDKGAAYVWIADMDVDCDGIDYK-CKGNPD-

A.niger ASSVPSKATYPVNTDDDSPKSTIHSDWVKFNQGAALSWVADMDVDCDGIDYK-CKGNGD-

A.oryzae-1 ASKVPSHATYPIG--QGSTKSTIHSDWAGFSEGAAFSFIADMDVDCDGLNHG-CKGNPD-

A.oryzae-2 ASKVPSHATYPIG--QGSTKSTIHSDWAGFSEGAAFSFIADMDVDCDGLNHG-CKGNPD-

A.fumigatus ATKVPSLATYPVSQDKGAAKSTIHTDWASFSEGASISWVADMDVDCDGLNSG-CQGNPD-

S.avermitilis CSQI-SNGKY--KTDDETS-ATI----PVCGKNGAVFWKADMDIDCDGQVTGKCNGTTDP

S.griseus CSRI-SKGAY--RTDSGASRATV----PVCGTGDAVFWKADMDIDCDGRETKACSRKTDP PgChP -GQHQTNFGA---LAAYEVPFFVIPD--RFGTKYAKQLPGNNVGAVIC----NGKMFY

A.niger -GLPETNWGA---LSAYEVPWIVIPD--QFLTANEDLLPGNNVAAVIC----NGKMYY

A.oryzae-1 -GQKETNWGA---LSAYEVPFIVIPQ--EFLDANKGTLKGNAVAAVIC----NGKMFY

A.oryzae-2 -GQKETNWGA---LSAYEVPFIVIPQ--EFLDANKGTLKGNAVAAVICATSSNGKMFY

A.fumigatus -GQPQTNWGA---LSAYEVPFIVIPD--KYLSANSGALPGNNIAAVIC----NGKMFY

S.avermitilis WFQDDTAFHQSDGKPLRADSLPYVVVPSSSSIWNYASAGIKGGGVVAVIY----NNKVEY

S.griseus YFLPETAFPSSRGEPLDSAVLPHVVVPGASKVWDYRRSGLTGGSVVAVVY----RDRVRY

PgChP GIYGDSDGDTPQVIGEASWLMARTCFPNDDLNGNSGHGDVDVTYILFTGDDSVLPSSALN

A.niger GILGDSNGDDPEVTGEASWLMARTCFPDDDLNGAEGHAEADVTCKPYT---RSALN

A.oryzae-1 GIFGDSNGDSPQVTGEASWLMARTCFPKEDLNGNKGHTAADVTYIVFTGDKAVLPSSALN

A.oryzae-2 GIFGDSNGDSPQVTGEASWLMARTCFPEEDLNGNKGHTAADVTYIVFTGDKAVLPSSALN

A.fumigatus GILGDSNGDSPQVTGEASWLMARTCFPNEGLNGNNGHTGVDVTYIVFTGKNAVLPSSALT

S.avermitilis AVVGDTG--PTKIIGEASYATAQALGIDPD--PETGGTDSGVTYILFKNS-QVSP---

S.griseus GVIGDTG--PTGIIGEASYAMAKTLGIDPD--PSTGGAESGVTYIAFKDS-RVSP---

PgChP KNYVTNFTTLRSMGDKLMTALAKNLKLVDGGDGGSP--TTTAGSNPT--SGSCEWEGHCA

A.niger KNYITNFSTLRSMGDKLVGALASNLGLTSSA---SGSTATCSWQGHCE

A.oryzae-1 KNYITNFDTLRSMGDSLVGALAKNLNLGGGGGNPPTTLTTTSIPEPTGGSGSCSWPGHCA

A.oryzae-2 KNYITNFDTLRSMGDSLVGALAKNLNLGGGGGNPPTTLTTTSIPEPTGGSGSCSWPGHCA

A.fumigatus KNYITNFTTLRSMGDKLVNALVSNLGLSGTPPTKTTTRVTTTTTKPT-SAASCSWAGHCL

S.avermitilis ---IESHSAAVSLGDSLAKQFLQNN---

S.griseus ---IESRARARSRGAERAREFVGR---

PgChP ---GASCKDE--- A.niger ---GAICSTEDDCSDDLVCDSGKCSSPDEDDGDDEDDEDEEENDEDDEDDDDE--- A.oryzae-1 ---GATCSSNDDCSDDLTCQNGKCASDGSAETCSWEGHCKGATCSSNDDCSDELACIS A.oryzae-2 GFKNKGATCSSNDDCSDDLACQNGKCASDGSAETCSWEGHCKGATCSSNDDCSDELACIS A.fumigatus ---GASCSSDDDCADALVCTAGKCSVDGA-ATCSWEGHCEGASCSSD--- S.avermitilis --- S.griseus --- PgChP ---NDCSDQLVCKSGKCPSD A.niger ---DDEDDE--- A.oryzae-1 GICSVDNGVETCEWEGHCEGASCSSHDDCDGNLACKNGKCSA- A.oryzae-2 GICSVDNGVETCEWEGHCEGASCSSHDDCDGNLACKNGKCSA- A.fumigatus ---DDCSDDLYCKSGSCTAP S.avermitilis --- S.griseus --- 00 $1 22 00 $1 22 00 $1 , 22

De las quitosanasas fúngicas conocidas, sólo dos están producidas por mohos del género Penicillium, concretamente P. islandicum y P. spinulosum (Fenton y Eveleigh, 1981; Ak y col., 1998), no habiéndose descrito hasta el momento ninguna quitosanasa producida por P. chrysogenum. Por otra parte, aunque son frecuentes las glicosilaciones en proteínas con actividad antifúngica purificadas a partir de plantas (Islam y col., 2002; Deepak y col., 2003; Yamunarani y col., 2005), hasta el momento sólo se ha descrito este tipo de modificación postraduccional en las quitosanasas de Mycobacter AL-1 (Hedges y Wolfe, 1974) y P. islandicum (Fenton y Eveleigh, 1981).

Adicionalmente, tanto el peso molecular en torno a 30 kDa como el pI de 5 determinados para PgChP (Manuscrito 4), se encuentran dentro de los rangos descritos para otras quitosanasas, de entre 10 y 50 kDa y pIs entre 4 y 10 (Somashekar y Joseph, 1996). La quitosanasa glicosilada con 30 kDa y pI 4,2 de P. islandicum (Fenton y Eveleigh, 1981) es la más similar a PgChP desde el punto de vista bioquímico. No obstante, hasta el momento se desconoce su secuencia aminoacídica, por lo que no es posible establecer una homología entre ambas proteínas.

Por todo ello se puede afirmar que PgChP es una nueva quitosanasa de 30 kDa producida por P. chrysogenum incluida en la familia GH-75. Además, esta proteína ha mostrado actividad antifúngica frente a cepas de interés en alimentos (Acosta y col., 2009a), lo cual no ha sido comprobado en otras quitosanasas.

En relación con PgAFP, el análisis de las secuencias tanto aminoacídica como genética y su posterior comparación en bases de datos, permitió descartar la similitud con PgChP. Así, PgAFP mostró homología con un conjunto de proteínas con actividad antifúngica secretadas por mohos, concretamente: PAF de P. chrysogenum (Marx y col., 1995), AFP de A. giganteus (Nakaya y col., 1990; Lacadena y col., 1995), Anafp de A. niger (Lee y col., 1999) y AcAFP de A. clavatus (Skouri-Gargouri y Gargouri, 2008). Estas proteínas tienen una estructura primaria diferente a la descrita en otras proteínas antifúngicas producidas por plantas, invertebrados o anfibios, pero comparten características comunes con ellas, como su pequeño tamaño (51-60 aminoácidos; 5,8-6,7 kDa), alto contenido en residuos de cisteína y un marcado carácter básico debido a la presencia de lisina y arginina (Theis y Stahl, 2004). Adicionalmente, aunque hasta el momento no se han descrito modificaciones post-traduccionales en este tipo de proteínas, sí se han encontrado discrepancias en el peso molecular determinado mediante distintas técnicas. Concretamente PAF corresponde a una banda de unos 12 kDa en SDS-PAGE

(Marx y col., 1995), pero a partir de la secuencia aminoacídica deducida del gen su peso sólo se estima en 6,3 kDa (Marx, 2004); esta diferencia de masa también se aprecia en Anafp y AcAFP (Lee y col., 1999; Skouri-Gargouri y Gargouri, 2008). Estos resultados son similares a los expuestos anteriormente para PgAFP, si bien estas diferencias podrían atribuirse, como se indicó anteriormente, a su marcado carácter catiónico (Mondstadt y Holldorf 1990).

Por lo tanto, PgAFP no sólo muestra una gran similitud en sus secuencias genética y aminoacídica con este tipo de proteínas antifúngicas producidas por mohos, sino que también comparte otra serie de características comunes, ya que se trata de una proteína de 58 aminoácidos, con una masa molecular de 6,5 kDa y pI de 9,2. Además, tal como se recoge en la tabla V.2, esta proteína presenta otras características comunes, como un alto contenido de aminoácidos básicos y seis residuos de cisteína.

Tabla V.2. Parámetros de las formas maduras de las proteínas PgAFP, Anafp, PAF, AFP, y las deducidas de Penicillium nalgiovense (NAF), A. niger, Neosartorya fischeri y Giberella zeae.

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Los seis residuos de cisteína presentes en PgAFP están conservados en todas las proteínas antifúngicas de mohos (Marx, 2004), aunque AFP que posee dos residuos adicionales (Wnendt y col., 1994). De hecho, la gran estabilidad mostrada por este tipo de

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proteínas frente a proteasas, altas temperaturas o pHs extremos (Lacadena y col., 1995) se ha atribuido a la presencia de estos residuos, que estabilizan la estructura terciaria mediante la formación de puentes disulfuro (Campos-Olivas y col., 1995).

Con respecto a las proteínas antifúngicas producidas por mohos, sólo han sido caracterizados los genes que codifican AFP y PAF (Wnendt y col., 1994; Marx y col., 1995). Asimismo, se ha descrito un gen homólogo al que codifica PAF en P. nalgiovense, denominándose la proteína deducida NAF, aunque ésta no se ha purificado (Geisen, 2000). El análisis de las secuencias de aminoácidos revela homologías del 31 al 42% entre PAF, AFP y Anafp, mientras que PAF es 100 % idéntica a NAF. De las proteínas descritas y purificadas, Anafp mostró la mayor similitud con PgAFP, concretamente un 79%.

Tal como ya se ha indicado en el apartado anterior para PgAFP, tanto AFP como PAF son sintetizadas como preproproteínas, es decir contienen una secuencia péptido señal para su secreción y una prosecuencia que es eliminada antes o durante su liberación al medio (Marx, 2004). Con respecto a Anafp, aunque sólo se ha determinado la secuencia aminoacídica de la proteína madura (Lee y col., 1999), se asume por su gran similitud con el resto que también está codificada como preproproteína (Marx, 2004). En relación a la proteína AcAFP sólo se han descrito los 21 primeros aminoácidos, de los cuales 20 y 12 residuos coinciden con la región amino terminal de AFP y PAF respectivamente.

En los últimos años, gracias a la secuenciación del genoma de diferentes mohos, se han ido recogiendo en bases de datos proteínas deducidas que muestran similitud con este grupo de proteínas antifúngicas. De hecho PgAFP, al igual que PAF, AFP y Anafp, ha mostrado homologías con proteínas deducidas de N. fischeri y G. zeae (Manuscrito 2, figura 6). Una de estas proteínas deducidas, concretamente del genoma de A. niger, ha mostrado junto a Anafp una alta similitud con PgAFP, con un 75 y 79 % de homología, respectivamente. Por otra parte, a pesar de que tanto PgAFP como PAF son producidas por cepas de P. chrysogenum sólo mostraron un 43 % de homología, por lo que se trata de proteínas diferentes. Por último, las secuencias que codifican las proteínas PgAFP y PgChP se han localizado en el genoma de P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 cuya secuencia completa ha sido determinada recientemente (Van den Berg et al., 2008).

V. 4. MECANISMO DE ACCIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE PgAFP Y