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Diagnostico de los virus Herpes Simplex 

El diagnóstic

El diagnóstico o virolvirológico se ógico se puede realizar de puede realizar de variavarias s formformas dependiendo en as dependiendo en cada ocasióncada ocasión de que haya o no vesículas, de las características del huésped (edad, inmunoprosucesión, de que haya o no vesículas, de las características del huésped (edad, inmunoprosucesión, etc.) y del momento en que se realice la toma de la muestra.

etc.) y del momento en que se realice la toma de la muestra.

Atendiendo a los criterios anteriores, la estrategia diagnóstica será: Atendiendo a los criterios anteriores, la estrategia diagnóstica será: 1.- En

1.- En lolos s cacasososs donde haya lesión vesiculosa la técnica de elección es el diagnósticodonde haya lesión vesiculosa la técnica de elección es el diagnóstico directo a partir de improntas tomadas de la lesión. Los portaobjetos con las improntas se directo a partir de improntas tomadas de la lesión. Los portaobjetos con las improntas se fijan en acetona fría durante 15 minutos y se tiñen después con anticuerpos monoclonales fijan en acetona fría durante 15 minutos y se tiñen después con anticuerpos monoclonales marcados, habitualmente con fluoresceína. La eficacia diagnóstica de esta técnica está en marcados, habitualmente con fluoresceína. La eficacia diagnóstica de esta técnica está en relac

relación con el ión con el estadestado de o de lesilesión, variando desde el 100% en el ón, variando desde el 100% en el caso de vesículacaso de vesículas a s a un 25%un 25% cuando las impronta

cuando las improntas se s se realirealizan a zan a partipartir de r de las costraslas costras. El . El diagnódiagnósticstico o puede obtenerspuede obtenerse e enen 30 minutos.

30 minutos.

Igualmente debe realizarse una toma de la lesión para cultivo de virus, utilizando Igualmente debe realizarse una toma de la lesión para cultivo de virus, utilizando  para ello una torunda previamente humedecida en el medio de transporte de virus (solución  para ello una torunda previamente humedecida en el medio de transporte de virus (solución tamponada con rojo fenol, antibióticos y una fuente proteica, como albúmina). Lo más tamponada con rojo fenol, antibióticos y una fuente proteica, como albúmina). Lo más conveniente es inocular la muestra inmediatamente, pero si no es posible, se puede conveniente es inocular la muestra inmediatamente, pero si no es posible, se puede almacenar a 4ºC no más de 48 horas.

almacenar a 4ºC no más de 48 horas. Los cultivos rápidos (

Los cultivos rápidos (Shell vial Shell vial ) están indicados también para el diagnóstico precoz) están indicados también para el diagnóstico precoz

de la infección por VHS-1 y 2. Se realizan inoculando 200-300 µl de la muestra de la de la infección por VHS-1 y 2. Se realizan inoculando 200-300 µl de la muestra de la vesícula por centrifugación (700 X g, 45 min) sobre una monocapa de células susceptibles vesícula por centrifugación (700 X g, 45 min) sobre una monocapa de células susceptibles

(MCR-5, VERO o BGM) previamente crecidas sobre un cubreobjetos circular. Después de (MCR-5, VERO o BGM) previamente crecidas sobre un cubreobjetos circular. Después de retirar la muestra y añadir 1 ml de medio de mantenimiento, se incuban a 37ºC durante 24- retirar la muestra y añadir 1 ml de medio de mantenimiento, se incuban a 37ºC durante 24- 48

48 horashoras. . PostPosterioreriormente se mente se tiñen los tiñen los cubreocubreobjetobjetos s con anticuerpocon anticuerpos s monoclmonoclonales frente aonales frente a VHS-1. Marcados con fluoresceína y se observan

VHS-1. Marcados con fluoresceína y se observan al microscopio.al microscopio.

Los cultivos convencionales son necesarios para aislar las cepas y realizar ensayos Los cultivos convencionales son necesarios para aislar las cepas y realizar ensayos de sensibilidad, que están indicados fundamentalmente en pacientes inmunodeprimidos. La de sensibilidad, que están indicados fundamentalmente en pacientes inmunodeprimidos. La inoculación de los cultivos convencionales se realiza por absorción de la muestra a la inoculación de los cultivos convencionales se realiza por absorción de la muestra a la monocapa celular durante una hora a 37ºC (también se puede realizar por centrifugación). monocapa celular durante una hora a 37ºC (también se puede realizar por centrifugación). Se retira la muestra y se añade medio de mantenimiento. Los tubos se incuban a 37ºC y Se retira la muestra y se añade medio de mantenimiento. Los tubos se incuban a 37ºC y atmósfera de 5% de CO

atmósfera de 5% de CO22 durante 14 días. Estos tubos se observan periódicamente paradurante 14 días. Estos tubos se observan periódicamente para

visualizar el efecto citopático característico de VHS. La identificación final se realiza con visualizar el efecto citopático característico de VHS. La identificación final se realiza con los anticuerpos monoclonales de tipaje por la técnica de IF directa anteriormente descrita, los anticuerpos monoclonales de tipaje por la técnica de IF directa anteriormente descrita, sobre las células de la monocapa desprendidas, lavadas y fijadas con acetona fría.

sobre las células de la monocapa desprendidas, lavadas y fijadas con acetona fría. 2.- Cuando

2.- Cuando no existen lesiones vesiculno existen lesiones vesiculosas externas hay que osas externas hay que distidistinguir, a nguir, a su vez, su vez, cuatrcuatroo circunstancias:

circunstancias:

2.a) Procesos clínicos donde se produce excreción viral: faringitis, uretritis, cervicitis y 2.a) Procesos clínicos donde se produce excreción viral: faringitis, uretritis, cervicitis y neumonías (inmunodeprimidos). La detección del virus debe realizarse mediante cultivo neumonías (inmunodeprimidos). La detección del virus debe realizarse mediante cultivo rápido o convencional, siendo este último el método más sensible. Las muestras de elección rápido o convencional, siendo este último el método más sensible. Las muestras de elección sson on llos os exexududadados os de de lla a zozona na afafececttadada a ((fafarriningege, , ururetetrra, a, enendodocecerrvivix x y y llavavadadosos  broncoalveolares en las neumonías). En algunos casos, como por ejemplo en los exudados  broncoalveolares en las neumonías). En algunos casos, como por ejemplo en los exudados

fa

faríríngngeoeos, s, el el aiaislslamamieientnto o ha ha dedescscririto to exexcrcrececióión n dedel l vivirurus s en en un un 2% 2% de de inindidivividuduosos asintomáticos. En los lavados broncoalveolares, su implicación como agente etiológico va asintomáticos. En los lavados broncoalveolares, su implicación como agente etiológico va ligada a la ausencia de otros patógenos.

ligada a la ausencia de otros patógenos.

2.b) Queratitis, esofagitis, proctitis. Las muestras de elección en estos casos son los 2.b) Queratitis, esofagitis, proctitis. Las muestras de elección en estos casos son los raspados cornéales o biopsias respectivas. En estos casos el

raspados cornéales o biopsias respectivas. En estos casos el diagnóstico se hace mediante IFdiagnóstico se hace mediante IF sobre las improntas de las biopsias, cultivo (rápido y convencional), cocultivo y PCR. La sobre las improntas de las biopsias, cultivo (rápido y convencional), cocultivo y PCR. La PCR está indicada sólo cuando los cultivos son raspados y es fundamentalmente útil en los PCR está indicada sólo cuando los cultivos son raspados y es fundamentalmente útil en los

raspados cornéales, donde el rendimiento del cultivo es menor. Además, se puede utilizar la raspados cornéales, donde el rendimiento del cultivo es menor. Además, se puede utilizar la secreción lagrimal del ojo afectado como muestra para el diagnóstico por PCR.

secreción lagrimal del ojo afectado como muestra para el diagnóstico por PCR. Para el cocultivo se ponen en contacto 15x10

Para el cocultivo se ponen en contacto 15x1044_{células con el triturado de la biopsiacélulas con el triturado de la biopsia}

en 1,5 ml de medio de mantenimiento, suplementado con 5% de suero bovino fetal. A las en 1,5 ml de medio de mantenimiento, suplementado con 5% de suero bovino fetal. A las 24 horas y una vez formada la monocapa, se cambia el medio y se incuba a 37ºC y 24 horas y una vez formada la monocapa, se cambia el medio y se incuba a 37ºC y atmósfera de 5% de CO

atmósfera de 5% de CO22 durante 14 días observándolo periódicamente para visualizar eldurante 14 días observándolo periódicamente para visualizar el

efecto citopático. efecto citopático.

2.c) Encefalitis: debido a la eficacia y ausencia de reacciones adversas del tratamiento con 2.c) Encefalitis: debido a la eficacia y ausencia de reacciones adversas del tratamiento con aciclovir, no suele practicarse biopsia cerebral para el diagnóstico etiológico. Hoy día, la aciclovir, no suele practicarse biopsia cerebral para el diagnóstico etiológico. Hoy día, la PCR realizad

PCR realizada a a a partipartir r del líquido cefalorrdel líquido cefalorraquídeo (LCR), técnica mucho aquídeo (LCR), técnica mucho menos agresivmenos agresiva,a, se ha convertido en la alternativa diagnóstica de elección. Suele utilizarse una técnica de se ha convertido en la alternativa diagnóstica de elección. Suele utilizarse una técnica de doble PCR (

doble PCR (nested nested ) o, alternativamente, una PCR simple seguida de hibridación con sonda) o, alternativamente, una PCR simple seguida de hibridación con sonda

específica radiactiva o biotinada. específica radiactiva o biotinada.

La PCR múltiple, en la que se utiliza una mezcla de iniciadores de los diferentes La PCR múltiple, en la que se utiliza una mezcla de iniciadores de los diferentes herpesvirus, que posteriormente se identifican con unos segundos cebadores específicos herpesvirus, que posteriormente se identifican con unos segundos cebadores específicos   para cada uno de ellos. Es una técnica que ha sido desarrollada recientemente y con   para cada uno de ellos. Es una técnica que ha sido desarrollada recientemente y con

resultados prometedores. resultados prometedores.

2.d) Procesos con clínicos que van acompañados de viremia (herpes neonatal, herpes 2.d) Procesos con clínicos que van acompañados de viremia (herpes neonatal, herpes generalizados y viscerales en inmunodeprimidos), en ausencia de lesiones cutáneas. En generalizados y viscerales en inmunodeprimidos), en ausencia de lesiones cutáneas. En estos casos se puede detectar antígeno viral por IF directa o aislar el virus mediante cultivos estos casos se puede detectar antígeno viral por IF directa o aislar el virus mediante cultivos a partir de leucocitos de sangre periférica. Para la IF directa, con objeto de evitar la a partir de leucocitos de sangre periférica. Para la IF directa, con objeto de evitar la contaminación con eritrocitos, la muestra se trata con NH

contaminación con eritrocitos, la muestra se trata con NH44CI frío (5 minutos a -20º), antesCI frío (5 minutos a -20º), antes

de ponerla en el portaobjetos. de ponerla en el portaobjetos.  Diagnostico Serológico  Diagnostico Serológico

Su

Su ututililididad ad se se cicircrcununscscriribe be al al didiagagnónóststicico o de de prprimimoioinfnfececcicionones es y y en en esestutudidiosos epidemiológicos. En las enfermedades del sistema nervioso central también se utilizan los epidemiológicos. En las enfermedades del sistema nervioso central también se utilizan los índices de anticuerpos IgG totales y específicos LCR/suero, junto con el índice de albúmina índices de anticuerpos IgG totales y específicos LCR/suero, junto con el índice de albúmina

(indicativo de barrera hematoencefálica intacta o alterada) para demostrar producción (indicativo de barrera hematoencefálica intacta o alterada) para demostrar producción intratecal de anticuerpos específicos.

intratecal de anticuerpos específicos.

La Respuesta Serológica en el Diagnostico de la infección por los VHS La Respuesta Serológica en el Diagnostico de la infección por los VHS

Ante la sospecha de infección por los VHS, es muy importante que el laboratorio Ante la sospecha de infección por los VHS, es muy importante que el laboratorio tenga claros los objetivos que persigue,

tenga claros los objetivos que persigue, adecuando las diferentes técnicas diagnósticasadecuando las diferentes técnicas diagnósticas disponibles a las diferentes situaciones clínicas con las que se enfrente. Esta claridad de disponibles a las diferentes situaciones clínicas con las que se enfrente. Esta claridad de objetivos es fundamental para luego interpretar correctamente

objetivos es fundamental para luego interpretar correctamente los resultados obtenidoslos resultados obtenidos según cada situación concreta. El diagnóstico indirecto serológico, basado en la

según cada situación concreta. El diagnóstico indirecto serológico, basado en la

determinación de los anticuerpos específicos frente a los VHS, no resulta en general de determinación de los anticuerpos específicos frente a los VHS, no resulta en general de tanta utilidad como el diagnóstico directo basado en el aislamiento del virus o en la tanta utilidad como el diagnóstico directo basado en el aislamiento del virus o en la

aplicación de metodología molecular. Aun partiendo de esta premisa, no debemos olvidar  aplicación de metodología molecular. Aun partiendo de esta premisa, no debemos olvidar  que, debido al amplio espectro de infecciones por los VHS, vamos a encontrarnos ante que, debido al amplio espectro de infecciones por los VHS, vamos a encontrarnos ante casos en los que resulte necesario

casos en los que resulte necesario recurrir a la detección de anticuerpos recurrir a la detección de anticuerpos específicos de cadaespecíficos de cada tipo de virus, principalmente en el suero

tipo de virus, principalmente en el suero o en el líquido cefalorraquídeo o en el líquido cefalorraquídeo (LCR) del paciente.(LCR) del paciente. Esto ocurre sobre todo cuando

Esto ocurre sobre todo cuando el aislamiento del virus no resulte posible, en situaciones deel aislamiento del virus no resulte posible, en situaciones de negatividad del diagnóstico directo o

negatividad del diagnóstico directo o en aquellos casos (v.g. encefalitis) en los qen aquellos casos (v.g. encefalitis) en los que la tomaue la toma de una muestra adecuada suponga un riesgo no justificable. En estos casos el diagnóstico de una muestra adecuada suponga un riesgo no justificable. En estos casos el diagnóstico serológico aparece como una alternativa a utilizar o, incluso en ocasiones, el único modo de serológico aparece como una alternativa a utilizar o, incluso en ocasiones, el único modo de establecer la infección.

establecer la infección.

La investigación de los anticuerpos an

La investigación de los anticuerpos anti-VHS se realiza básicamente a partir delti-VHS se realiza básicamente a partir del suero del paciente aunque, en ocasiones, se pueden detectar de diversos líquidos biológicos, suero del paciente aunque, en ocasiones, se pueden detectar de diversos líquidos biológicos, entre los que destaca el LCR en los casos de afectación neurológica. Es importante señalar, entre los que destaca el LCR en los casos de afectación neurológica. Es importante señalar,  para poder detectar una hipotética seroconversión, la necesidad de obtener dos muestras de  para poder detectar una hipotética seroconversión, la necesidad de obtener dos muestras de

suero, al inicio de los síntomas y a

suero, al inicio de los síntomas y a los 15-21 días siguientes.los 15-21 días siguientes.

La ausencia de anticuerpos indica que el individuo no ha sido infectado por los La ausencia de anticuerpos indica que el individuo no ha sido infectado por los VHS. Tras la infección primaria se produce un

seguido posteriormente de un incremento de los IgG. Los de clase IgM, aunque pueden seguido posteriormente de un incremento de los IgG. Los de clase IgM, aunque pueden desaparecer al cabo de 3-6 meses, presentan perfiles muy variados para cada individuo, desaparecer al cabo de 3-6 meses, presentan perfiles muy variados para cada individuo,  pudiendo su persistencia indicar que la replicación viral continúa. En las infecciones  pudiendo su persistencia indicar que la replicación viral continúa. En las infecciones

recurrentes pueden persistir o reaparecer los anticuerpos IgM, lo

recurrentes pueden persistir o reaparecer los anticuerpos IgM, lo que ocurre también tras lasque ocurre también tras las infecciones secundarias herpéticas graves como la encefalitis, aunque su negatividad no infecciones secundarias herpéticas graves como la encefalitis, aunque su negatividad no excluye el diagnóstico. Las IgG persistirán elevadas prácticamente

excluye el diagnóstico. Las IgG persistirán elevadas prácticamente de por vida, por lo qde por vida, por lo queue su detección no podrá utilizarse como signo de infección activa. Tan sólo implican que el su detección no podrá utilizarse como signo de infección activa. Tan sólo implican que el individuo ha sido infectado por el VHS-1, VHS-2 o ambos. También suponen que es individuo ha sido infectado por el VHS-1, VHS-2 o ambos. También suponen que es  portador del VHS en los ganglios sensitivos y que

 portador del VHS en los ganglios sensitivos y que el virus puede reactivarseel virus puede reactivarse

intermitentemente. Para documentar el estado inmunitario de un individuo frente a los VHS intermitentemente. Para documentar el estado inmunitario de un individuo frente a los VHS se han descrito numerosos métodos serológicos, entre los que los más eficaces y

se han descrito numerosos métodos serológicos, entre los que los más eficaces y disponibles comercialmente se basan en técnicas

disponibles comercialmente se basan en técnicas de EIA. Sin embargo, la elevadade EIA. Sin embargo, la elevada reactividad cruzada entre el VHS-1 y el

reactividad cruzada entre el VHS-1 y el VHS-2 cuando se utilizan antígenos crudos haVHS-2 cuando se utilizan antígenos crudos harárá imposible diferenciar entre una infección pasada por uno u otro virus. La necesidad de imposible diferenciar entre una infección pasada por uno u otro virus. La necesidad de solucionar este problema desde el punto

solucionar este problema desde el punto de vista del manejo práctico en de vista del manejo práctico en las diferenteslas diferentes situaciones clínicas ha hecho que,

situaciones clínicas ha hecho que, en los últimos años, se hayan desarrollado métodosen los últimos años, se hayan desarrollado métodos

 basados en antígenos específicos de tipo. Ambos virus poseen aproximadamente un 83% de  basados en antígenos específicos de tipo. Ambos virus poseen aproximadamente un 83% de

homología en su secuencia nucleotídica, lo que se traduce en una marcada reactividad homología en su secuencia nucleotídica, lo que se traduce en una marcada reactividad serológica cruzada. El descubrimiento en los años 80 de la glucoproteína G (gG), con serológica cruzada. El descubrimiento en los años 80 de la glucoproteína G (gG), con diferencias en la antigenicidad según

diferencias en la antigenicidad según el tipo de virus, permitió, en cierto modo, el tipo de virus, permitió, en cierto modo, lala resolución del problema, facilitando el desarrollo de p

resolución del problema, facilitando el desarrollo de pruebas específicas de tipo dirigidas aruebas específicas de tipo dirigidas a la detección de anticuerpos IgG e IgM.

la detección de anticuerpos IgG e IgM. Técnicas disponibles en

Técnicas disponibles en el el diagnostico serológico de los diagnostico serológico de los VHS.VHS. La necesidad de identificar los dos

La necesidad de identificar los dos tipos de VHS ha justificado el desarrollo detipos de VHS ha justificado el desarrollo de métodos serológicos, en particular de enzimoinmunoensayo, con el objetivo principal de métodos serológicos, en particular de enzimoinmunoensayo, con el objetivo principal de diferenciar los anticuerpos específicos de cada tipo.

diferenciar los anticuerpos específicos de cada tipo. Sin embargo, en la actualidad Sin embargo, en la actualidad existenexisten