1.3.1 Tipos de copigmentación 1.3.1.1 Autoasociación
Cuando la concentración de pigmentos es relativamente alta, las antocianinas mismas, pueden actuar como copigmentos y participar en reacciones de auto-asociación. En estudios sobre el equilibrio de las antocianinas en solución acuosa, se ha observado que no se sigue la Ley de Lambert-Beer, excepto para soluciones muy diluídas. Asen et al. (1972) encontraron que un incremento en la concentración de cianidina-3,5-diglucósido a pH 3.16 provocaba incrementos no proporcionales en la absorbancia de la solución. Este efecto fue atribuido a la auto-asociación de moléculas de antocianinas. Estudios subsecuentes de la auto-asociación de malvidina-3-glucósido por RMN, mostraron que tanto la forma de ion flavilio como la forma quinoidal, pueden formar apilamientos verticales con un giro en el sentido de las manecillas del reloj, y se mantienen juntos gracias a interacciones electrostáticas e hidrofóbicas (Hoshino, 1992).
1.3.1.2 Copigmentación Intramolecular
Estudios recientes sugieren que el acomplejamiento molecular de las antocianinas con otros fenoles, denominados copigmentos es el responsable de la estabilización del color en las plantas (Davies et al., 1993; Brouillard et al., 1989; Mazza y Brouillard, 1990).
La copigmentación consiste en el apilamiento de moléculas de copigmento sobre el núcleo plano de las formas coloridas de las antocianinas. De esta forma, el ataque nucleofílico del agua en la posición 2 del núcleo de pirilio, que conduce a las formas incoloras de hemiacetal y chalconas, es prevenido parcialmente (Figura 1.1) (Dangles y Amiot, 2001). La copigmentación en un fenómeno ampliamente distribuido en la naturaleza y puede ocurrir en productos derivados de frutas y verduras, como jugos y vinos. Este fenómeno se vuelve más eficiente cuando el pigmento y el copigmento se encuentran unidos a través de un espaciador. Tal es el caso de las antocianinas, en las que las glicosilaciones se encuentran aciladas (frecuentemente en la posición 6-OH) por ácidos fenólicos. Dentro de estas moléculas aciladas, la copigmentación consiste en un arreglo conformacional de los grupos acilo sobre el núcleo del ion flavilio (copigmentación intramolecular) (Dangles et al., 1993).
Los residuos de azúcares unidos a las antocianinas pueden encontrarse acilados con ácidos aromáticos como p-cumárico, caféico, ferúlico, gálico o por ácidos p-hidroxibenzoicos, y/o por ácidos alifáticos como malónico, acético, málico, succínico, etc. También se han reportado antocianinas que tienen dos o más grupos acilos, como la cianodelfinidina, rubrocinearina, ternatinas y lobelinas, etc. (Jackman y Smith, 1996). Esta acilación posee un efecto estabilizante en las antocianinas, a través de la copigmentación intramolecular, esto es a través del apilamiento tipo sándwich de los grupos acilo, con el anillo de pirilio de la molécula de antocianina y este efecto es más aparente para el caso de las moléculas con acilos aromáticos. Hay que mencionar que las antocianinas monoaciladas, por lo general no presentan el efecto estabilizador de las antocianinas di, tri o poliaciladas, indicando que al menos dos grupos acilo son necesarios para una buena estabilidad y retención de color en medios ligeramente ácidos ó neutros (Jackman y Smith, 1996). Las antocianinas aciladas, son particularmente prometedoras como colorantes de alimentos, debido a su gran estabilidad de color en el rango de pH de 4-5, donde las antocianinas no aciladas son casi incoloras. En la industria de alimentos, algunas fuentes comunes de estas antocianinas son Tradescantia pallida, Zebrina pendula, zanahoria morada y col roja (Dangles y Amiot, 2001).
1.3.1.3 Copigmentación Intermolecular
La adición de compuestos no coloreados (copigmentos), en soluciones de antocianinas ligeramente ácidas, produce un incremento en la longitud de onda de máxima absorbancia (λmax), conocido como cambio batocrómico, y un incremento en la absorbancia en el espectro visible, llamado cambio hipercrómico, por un mecanismo análogo a la autoasociación. La magnitud del efecto del copigmento en tales soluciones es dependiente de la estructura así como de la cantidad de antocianina y molécula de copigmento presente, del pH, la temperatura, y la composición de la solución empleada como solvente (Mazza & Brouillard, 1990).
Estas modificaciones en las propiedades espectrales probablemente apuntan al hecho de que la molécula de copigmento interactúa con al antocianina en su primer estado excitado (transiciones electrónicas en el rango visible) mas fuertemente que con su estado basal (Alluis et al., 2000).
Robinson y Robinson (1931) describieron por primera vez la copigmentación intermolecular con diferentes compuestos, y su capacidad de copigmentar soluciones de malvidina 3-glucósido. Los tipos de moléculas que pueden actuar como copigmentos exógenos para antocianinas incluyen flavonoles, flavan-3-oles, ácidos fenólicos, alcaloides, aminoácidos, y en el caso de la auto-asociación, las antocianinas (Asen, 1972). Los mejores copigmentos encontrados son por mucho, los flavonoles, sin embargo el principal prerrequisito de un copigmento es que contenga un anillo plano rico en electrones π, lo cual permite un solapamiento π-π con el anillo de pirilio del ion flavilio (Brouillard y Dangles 1994).
La concentración de ambos, las antocianinas, y las moléculas de copigmento, influencian la magnitud del efecto de la copigmentación (Mazza y Brouillard, 1990). Al incrementar al concentración de antocianinas, se incrementa la absorbancia así como el cambio batocrómico. Sin embargo, la magnitud del incremento en la absorbancia es dependiente de la proporción copigmento:pigmento para una determinada antocianina. El incremento en esta proporción, también incrementa la magnitud de los cambios hipercrómicos y batocrómicos (Covarrubias 2001, Del Follo, 2003).
En estudios sobre antocianinas de uva muscadina Talcott, y otros (2003) demuestran la dependencia de los cambios hipercrómicos y batocrómicos con la concentración de compuestos fenólicos provenientes de extractos acuosos de romero (Rosmarinus officinalis).
En su estudio, el color de los jugos de uva muscadina se incrementa en un 120% con la adición de dichos extractos.
1.3.1.4 Copigmentación con iones metálicos
La cianidina, la cual posee dos grupos hidroxilo adyacentes, tiene la propiedad de acomplejar metales como el aluminio en solución metanólica acidificada, lo que provoca una modificación en el máximo de absorción a 567 nm mientras que la pelargonidina 3-glucósido no es afectada, debido a la ausencia de hidroxilos en posición orto (Wrolstad et al., 1970).
Se ha estudiado con anterioridad el papel que juega el ácido cítrico, que es el principal ácido orgánico presente en las fresas, y se sabe que preferentemente reacciona con iones metálicos, dejándolos no disponibles para el acomplejamiento previamente descrito. Jurd y Asen (1966) estudiaron la copigmentación de cianidina 3-glucósido con quercetina, ácido clorogénico y metil-galato, y hallaron que la presencia de sales metálicas era esencial para al formación del copigmento en soluciones acuosas. El ácido cítrico, al estar acomplejado con el metal, impide la formación del complejo copigmento-metal-antocianina, responsable de un indeseable corrimiento hacia el azul de algunas variedades de fresas congeladas. Aunque el ácido cítrico es el principal ácido presente en la fresas, también se encuentran el málico, shikímico, succínico, glicérico, glicólico y aspártico. La magnitud de dicho efecto depende del tipo de ácido orgánico presente (Wrolstad et al., 1970).
1.3.2 Uso de extractos fenólicos como estabilizadores de antocianinas
En ausencia de mecanismos estabilizadores de color, las formas coloridas de las antocianinas, se hallan en menor proporción en soluciones acuosas ligeramente ácidas. Como una consecuencia de esto, se deduce que la gran variedad de colores naturalmente expresados por las antocianinas, debe ser estrictamente controlado por la copigmentación y el acomplejamiento metálico (para el caso de las antocianinas con un grupo 1,2-dihidroxibenceno en el anillo B) (Dangles y Amiot, 2001). Es sabido desde hace tiempo que los flavonoides están comúnmente asociados con las antocianinas en las plantas, por lo que se ha sugerido el uso de algunos de estos compuestos para mejorar la estabilidad de pigmentos como las antocianinas en alimentos (Lenoble, 1999). Por ejemplo, se ha demostrado la eficacia de extractos acuosos de romero (Rosmarinus officinalis), el cual es rico en flavonoides en la estabilización del color proveniente de antocianinas (Covarrubias 2001; Del Follo, 2003; Talcott, et al., 2003).
La formación de complejos entre las antocianinas y los copigmentos en condiciones ácidas, mejora las cualidades visuales y la estabilidad del color en los alimentos que los contienen. La estabilidad de las antocianinas copigmentadas en presencia de ácido ascórbico fue conocida recientemente, y actúa proporcionando un efecto quimoprotector durante el procesado de los alimentos (Talcott, et al., 2003).
Del Follo (2003) reporta la copigmentación de las antocianinas en el jugo de uva con extractos fenólicos de romero y tomillo, como un medio efectivo para la protección contra la reacción de blanqueado con bisulfitos, y este efecto estabilizador, es más efectivo para un extracto derivado del tomillo. Talcott, y otros, (2003) reportaron incrementos batocrómicos de 10 a 27% por la adición de extractos de romero en jugo de uva, dichos incrementos son dependientes de la concentración de extracto agregada. Sin embargo, la problemática sigue siendo la capacidad de estos extractos fenólicos para ser usados como sustratos de polifenoloxidasa; por lo cual, surge la necesidad de contar con extractos fenólicos que sin perder su capacidad de actuar como buenos copigmentos, no contribuyan al incremento de agentes oxidantes que mermen la concentración de antocianinas y de otros fitonutrientes, es decir, que no puedan ser usados como sustratos por la polifenoloxidasa.
CAPITULO 2
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE TOMILLO LIBRES DE SUSTRATOS DE POLIFENOLOXIDASA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA.