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Se ha de tener presente que si se extendiera en una hebra única el ADN de una sola célula humana mediría casi 2 metros de largo. Nos encontramos ante un tipo de biomolécula que puede contener una información equivalente a unas 600.000 pági- nas impresas de 500 palabras cada una, o a una biblioteca de aproximadamente 1000 libros. Con lo cual, es lógico pensar que la duplicación del ADN se tiene que llevar a cabo de una forma muy controlada y secuencial. Por ello, la primera idea de la que tenemos que partir es que la replicación de los cromosomas eucarióticos se inicia en orígenes múltiples.

Los trabajos iniciales de la síntesis del ADN utilizaron células procariotas para estudiar los mecanismos que regulan la replicación. Los fundamentos en la replica- ción son muy parecidos, aunque, tal como veremos, en las células eucariotas resulta ser más complicado.

La duplicación del ADN es un proceso que requiere aporte energético. Éste se obtie- ne a partir de las moléculas de deoxinucleótidos que contienen tres fosfatos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Las moléculas de nucleótidos compuestas por tres grupos fosfatos se van uniendo a la cadena molde siguiendo el principio de complementariedad de las bases nitogrenadas. De esta forma, por ejemplo, una molécula libre de dTTP se une median- te puentes de hidrógeno con la base complementaria adenina de la cadena molde de ADN. El ADN polimerasa se encarga de catalizar el proceso de unión de un nucleóti- do con otro en la formación del polímero. Se produce pirofosfato (PPi) como produc- to de la reacción liberando la energía suficiente para catalizar la formación de un enla- ce fosfodiester entre el extremo terminal 3’ del grupo hidroxilo de la cadena de ADN en formación y el primer fosfato del deoxinucleótido que se acaba de unir.

El proceso de duplicación del ADN tiene dos fases claramente diferenciadas: 1. Iniciación.

2. Elongación.

Durante la fase de iniciación, diferentes proteínas se encargan de separar y de preparar las dos cadenas de molécula de ADN. En la fase de elongación, lo que suce- de es que diferentes moléculas se encargan de conectar la secuencia correcta de nucle- ótidos en las dos nuevas cadenas en formación.

El proceso de duplicación del ADN comienza con el desenrollamiento del ADN y la separación parcial de las dos cadenas que conforman la molécula de ADN. Recordemos que estas cadenas se encuentran unidas mediante puentes de hidrogeno a través de las bases nitogenadas siguiendo el principio de complementariedad entre bases púri- Figura 61. El ADN polimerasa se encarga de catalizar la formación de enlaces covalentes a partir de la energía de los nucleótidos trifosfatos que se van uniendo a la cadena de ADN en crecimien- to. La síntesis del ADN siempre se lleva a cabo en la dirección de 5’ a 3’, de tal forma que la cade- na molde se dispone en la dirección de 3’ a 5’ y los nuevos nucleótidos de la cadena en forma- ción se van uniendo en la dirección 5’a 3’ para que las dos cadenas sean antiparalelas. En la figura podemos ver el ADN polimerasa catalizando la unión covalente (enlace fosfodiester) del primer grupo fosfato de una molécula de dATP con el extremo 3’ del grupo hidróxilo del último nucleótido en la hebra en formación. Del mismo modo, se puede observar en la figura la formación de puentes de hidrogeno entre las bases nitrogenadas de las dos hebras siguiendo el principio de complemen- tariedad entre las bases (adenina con timina y citosina con guanina). (Adaptada de Hartwell y col., 2008).

cas y pirimidínicas. Las proteínas que necesitan energía (ATP) para romper estos puen- tes de hidrogeno, desnaturalizando la doble hélice de ADN son las helicasas.

La región del ADN que se encuentra abierta (las bases se encuentran separadas) se denomina burbuja de replicación. En dicha región se crean dos áreas en forma de ‘Y’, cada una de estas dos áreas se denominan horquillas de la replicación. La formación de estas horquillas se inicia en relación a las proteínas estabilizadoras. Éstas desempe- ñan la función de mantener la separación de los dos filamentos complementarios.

Una vez separadas las dos cadenas, cada una de ellas servirá como molde para la formación de las nuevas cadenas de ADN. El complejo enzimático ADN polimerasa III es el encargado de llevar a término la formación de estas nuevas cadenas.

Una vez formada la horquilla de replicación, existen diferentes proteínas que se encargan de estabilizarla facilitando la disminución de la tensión de enrollamiento producida por la replicación.

Dicha tensión puede producir un superenrollamiento. Para disminuir la tensión y evitarlo es importante el papel del ADN girasa (un enzima del grupo de las ADN topoi- somerasas II en la Escherichia coli).

Figura 62. Burbuja de replicación con sus dos horquillas. El ADN helicasa es atraído por el inicia- dor proteico de la replicación (las primeras proteínas que reconocen y se unen al origen de la replicación). (Adaptada de Hartwell y col., 2008).

Figura 63. En 1956 Kornberg, un discípulo de Severo Ochoa, aisló un enzima que era capaz de formar polímeros de nucleótidos creando las cadenas de ADN en modelos in vivo: el ADN polime- rasa. Hoy sabemos que las moléculas de ADN polimerasa se encuentran implicadas en la síntesis del ADN. A través del estudio de diferentes cepas mutantes de Escherichia coli, se ha podido com- probar que la polimerasa responsable de la replicación in vivo es el ADN polimerasa III.

La fase de elongación consiste en la conexión de las secuencias correctas de nucle- ótidos en la nueva cadena de ADN. De este modo, la síntesis del ADN se produce en dirección 5’ -3’, para ello un enzima denominado primasa (un ARN polimersa) comien- za el proceso de formación del ADN en localizaciones concretas de la cadena molde, formando un pequeño trozo de ARN que actuará como cebador al proporcionar un extremo 3’ para que el ADN polimerasa III pueda iniciar la formación del polímero de ácido nucleico. El cebador de ARN se debe extraer y tiene que reemplazarse por ADN. Este paso parece ser controlado por el enzima ADN polimerasa I que eliminará el cebador de ARN y reemplazará los nucleótidos.

La doble cadena de ADN es antiparalela, es decir el sentido de las dos cadenas es diferente debido a que presentan diferente polaridad. Una de las cadenas está dispues- ta en el sentido 5’ a 3’, mientras que la otra lo está en el sentido 3’ a 5’. Por ello, en un extremo de la molécula de ADN, una de las cadenas acaba con un grupo hidroxi- lo en la posición 3’ mientras que la otra acaba en un grupo fosfato en la posición 5’. Debido a esta característica de la estructura y conformación del ADN, el ADN poli- merasa III lleva a cabo el proceso de polimerización en la cadena líder siguiendo el sentido 5’ a 3’ de una forma continua. ¿Qué sucede en la cadena opuesta? En la cade- na paralela, el proceso de replicación se lleva a término de una forma retrasada (es por ello, que se identifique frecuentemente como cadena retrasada). Para llevar a cabo la polimerización se necesita de la utilización de pequeños fragmentos, los fragmentos de Okazaki. Cada fragmento de Okazaki se une a un cebador de ARN. Al tratarse de una síntesis discontinua del ADN en la cadena retrasada, es necesario eliminar el cebador de ARN (que proporciona en extremo 3’ para poder polimerizar siguiendo el sentido 5’ a 3’) y unir los fragmentos de Okazaki. Éstos serán ensamblados por el ADN ligasa.

La síntesis en las cadenas adelantada y retrasada se puede llevar a cabo de una forma simultánea en una única horquilla de replicación. El ADN polimerasa III actúa en díme- ros realizando la polimerización en cada una de las cadenas. La cadena retrasada forma un bucle o lazo para modificar la dirección física de la síntesis de ADN. Cada mitad de la ADN polimerasa III dimérica se une a una de las cadenas molde median- te una abrazadera deslizante.

La duplicación del ADN es un proceso bidireccional, existe una helicasa que tra- baja en un sentido y otra que trabaja en sentido opuesto.

En las células eucariotas, la síntesis del ADN es muy parecida a la de las células procariotas, aunque resulta ser más compleja. Una primera diferencia que nos encon- tramos es que los cromosomas de las células eucariotas tienen múltiples inicios de la replicación. Un segundo aspecto importante claramente diferenciador es la cantidad de ADN polimerasas implicadas en la replicación del ADN eucariótico. Parece ser que las polimerasas α, δ y ε son críticas para la replicación del ADN nuclear, mientras que

las polimerasas β y ζ estarían implicadas en la reparación del ADN. La polimerasa γ, por su parte, parece estar implicada en la replicación del ADN mitocondrial. Otro aspecto importante a tener presente es que el ADN de las células eucariotas se encuen- tra asociado a proteínas (histonas). Esto implica que en la duplicación del ADN, se tiene que llevar a cabo una distribución de los nucleosomas.

Hemos de tener presente que los cromosomas eucarióticos son lineales y no cir- culares como en los organismos procariotas. Esta conformación implica un proble- ma que ocurre durante la replicación y que afecta a los extremos de los cromosomas lineales: aparece un hueco después de la síntesis de la cadena retrasada. Aquí desem- peña un papel esencial un enzima: la telomerasa. Ésta es capaz de añadir repeticio- nes de nucleótidos al extremo 3’ de la cadena retrasada. La telomerasa permite que los extremos del cromosoma (telomeros) puedan actuar como inicio de replicación. Mediante la extensión de los extremos 3’ de los extremos del cromosoma, la telome- rasa impide la pérdida de los telomeros.