Kinematics

La presencia de polimorfismos en una secuencia de ADN y/o la exposición a algu- nos factores ambientales pueden alterar la cantidad expresada de determinados genes. Así, el nivel al cual convergen la genética y los factores ambientales es la expresión géni- ca. De esta forma el perfil de expresión en cerebro podría ser más informativo acerca de la etiología de los comportamientos complejos que el estudio de los factores genéticos y ambientales por separado. Pero además, estas técnicas cuantitativas también pueden emplearse para detectar mutaciones en el ADN por duplicación o depleción de exones.

2.4.1. Análisis de la expresión genética mediante PCR cuantitativa

Métodos descritos anteriormente, como el Northern blot, pirosecuenciación o chips de ADN, pueden ser utilizados para cuantificar la cantidad de ácidos nucleicos presentes en una muestra. Sin embargo, el método más extendido y sensible es la téc- nica de la PCR cuantitativa a tiempo real, utilizando sondas TaqMan. Para ello se uti- liza la misma tecnología explicada en el apartado 2.3.8, solo que en aquel caso se obser- vaba la fluorescencia al final de los ciclos de PCR, y en este método es necesario ir observando el incremento de fluorescencia en cada ciclo.

En vez de sondas TaqMan se puede utilizar el reactivo SYBR green, el cual es un agen- te intercalante que se une de forma estequiométrica al DNA de doble cadena, siendo entonces fluorescente. Sin embargo este sistema puede ser más problemático, ya que el SYBR green se puede unir a productos de PCR no específicos (incluyendo artefactos presentes en las PCRs conocidos como dímeros de oligonucleotidos) que pueden inter- ferir con la cuantificación especifica del fragmento de ADN que estemos analizando.

Como se explicó en el apartado 2.1.1 el número de moléculas de ADN en una PCR se incrementa teóricamente según la función Ni x 2n_{. Así, la concentración relativa}

de ADN o ADNc durante la fase exponencial se puede representar en escala logarit- mica en base 2, expresando la cantidad de fluorescencia respecto al número de ciclos. De esta forma el crecimiento exponencial se presenta en forma de una recta en una fase de la gráfica. Pasado un determinado ciclo, y debido al agotamiento de los reac- tivos, la fase exponencial se atenúa y entra en una fase de “plateau”, estacionaria o de punto final (Figura 19). La cantidad total de fluorescencia en la fase de plateau depen- de más de la cantidad de oligonucleótidos original, que de la cantidad inicial de ADNc que queremos cuantificar. Es pues la fase exponencial la que utilizamos para analizar la expresión: es la parte de la gráfica en que realmente se cumple la fórmu- la Ni x 2n_{. El ciclo al cual la fluorescencia de una muestra dada alcanza un determi-}

nado valor umbral arbitrario (threshold), pero dentro de la fase exponencial, se le llama Ct (Cycle threshold). Como la cantidad de ADNc se dobla cada ciclo durante la fase exponencial, se pueden calcular los niveles relativos de una muestra con respec- to a la otra. Por ejemplo, dos muestras que tengan una diferencia de 4 en el Ct, sig- nifica que el que tiene el Ct más bajo tendría 24_{= 16 veces más cantidad de ese frag-}

mento de ADNc.

Figura 19. Gráfico de resultados de una PCR cuantitativa. Se representa el incremento de fluo- rescencia, en escala logarítmica en función de los ciclos de PCR. Se ha fijado un valor umbral o threshold arbitrario para efectuar las comparaciones, pero siempre dentro de la fase exponencial. Se analizan dos muestras por triplicado. Los triplicados de la misma muestra demuestran la pre- cisión de la técnica, ya que se solapan sus valores de fluorescencia.

Sin embargo esto es teórico. En la práctica no basta para saber si ese determina- do gen se expresa más en una muestra que en la otra, ya que pueden existir diferen- cias en la concentración de ADNc total que había inicialmente (Ni), ya sea por dife- rencias en la extracción de ácidos nucleicos o por diferencias intrínsecas de expresión general entre las muestras. Se han de normalizar los resultados utilizando un control interno, es decir ajustando en función de la cantidad de un gen control endógeno en cada muestra (housekeeping gene). Un control endógeno sería un gen necesario para el mantenimiento básico de la célula y que presuntamente no esta sujeto a grandes cambios en la regulación de la expresión, con lo cual mantendría sus niveles de ARN relativamente constantes. No siempre es fácil encontrar un gen control adecuado, por ello es aconsejable utilizar la media geométrica de varios genes control para realizar la normalización.

La diferencia entre el ciclo en que se alcanza el valor umbral del gen estudiado y el valor umbral del gen de control endógeno (o de la media geométrica de varios genes control) es: ΔCt=Ct(Gen estudiado) – Ct (Genes de control endógeno). También podemos normalizarlas respecto a una muestra, escogida arbitrariamente, que nos servirá de referencia (muestra calibradora). Así, se obtendrá la cantidad relativa del gen estudiado en todas las muestras respecto a la muestra patrón, utilizando la fór- mula:

ΔΔCt (Muestra testada) = ΔCt(Muestra testada) - ΔCt(Muestra calibradora). A partir de este valor se obtiene fácilmente la información de cuanto se expre- sa cada una de las muestras con relación a la muestra calibradora, utilizando la fór- mula 2-(ΔΔCt)(de Ni x 2n_{). Pongamos un ejemplo: estamos estudiando la expresión}

del gen DRD2 en dos muestras diferentes, A y B, y utilizamos como control endó- geno el gen GAPDH. Los valores de Ct en la muestra A son Ct=30 para GAPDH y Ct=32 para el gen DRD2 mientras que los valores de Ct en la muestra B son Ct=32 para GAPDH y Ct=35 para DRD2. ¿Cual de las dos muestras presenta más canti- dad relativa del gen DRD2?. Aplicando la fórmula anterior compararemos la mues- tra B con respecto a la A (que hemos tomado como referencia, arbitrariamente): ΔΔCt (Muestra B) = ΔCtB(35-32) – ΔCtA(32-30)= ΔCt(3) - ΔCt(2)=1. Aplicando la

fórmula obtendremos que en la muestra B hay menos cantidad relativa de trans- critos de DRD2. La mitad concretamente: (2-ΔΔCt= 2-(1)_{=1/2). Utilizando estos valo-}

res normalizados ya se pueden comparar los controles con los casos utilizando los test estadísticos adecuados.

Es posible que la eficiencia de la reacción de amplificación en un ensayo o gen determinado no sea del 100%, sino menor, por lo que se puede ajustar en la fórmu- la 2ΔCt. Por ejemplo, en el caso de que la eficiencia de moléculas amplificadas de un gen en cada ciclo sea del 90%, entonces se calculará según: 0.9 x 2= 1.8ΔCt.

Para determinar esta eficiencia en cada ensayo existen diferentes métodos. Se pueden hacer diluciones seriadas de una muestra para determinar el Ct en cada una de ellas. A partir de estos valores de cada dilución se hace una recta de regresión, y la eficiencia se calcula mediante la fórmula: Eficiencia=10-1/pendiente de la recta _(suponiendo

en este caso que las sucesivas diluciones se realicen en factor diez).

También existen otros métodos basados en las cinéticas de reacción; en los cua- les se analizan los valores de fluorescencia de cada muestra y en cada ciclo. Para ello se utiliza la regresión lineal en la fase exponencial para calcular directamente la efi- ciencia en cada muestra, utilizando la fórmula anterior, y sin necesidad de utilizar dilu- ciones seriadas de una muestra artificial.

Afortunadamente, no hay que hacer estos cálculos a mano. Existen algunos pro- gramas que hacen todos estos cálculos de la eficiencia de forma sencilla como DART- PCR. Otros programas como Qbase o GeNex calculan las cantidades relativas de cada gen mediante el método ΔΔCt, pudiendo utilizar varios controles endógenos y ajus- tando la eficiencia para cada gen (programas accesibles en http://gene- quantification.com/, http://www.tataa.com/).

El método de cuantificación génica relativa es útil en muchos casos en los cuales lo que se pretende es definir si existen alteraciones de expresión entre dos o más gru- pos de muestras. Sin embargo, para algunas aplicaciones es conveniente llevar a cabo una cuantificación absoluta, es decir, determinar el número de copias del fragmento de ADNc que hay en una muestra determinada. Por ejemplo cuando se quiere deter- minar con exactitud la carga vírica de un paciente. En este caso tendremos que hacer ineludiblemente una recta patrón (regresión) con diluciones seriadas, a partir de una muestra de concentración conocida, y, a partir de la misma determinar el número de copias de la muestra que testamos (Pfaffl).

2.4.2. Análisis de expresión masiva (microarrays).

Igual que en el caso del análisis de asociación con SNPs, en determinadas ocasio- nes no se parte de una idea inicial acerca de que genes pueden estar involucrados en una rasgo fenotípico en concreto, y es necesario analizar todos los genes de un teji- do u organismo. Para ello es necesario contar con la tecnología adecuada para reali- zarlo a tiempo y coste razonables. Los chips de ADN se pueden usar para detectar ARN en análisis de expresión en los cuales pueden ser analizados miles de transcritos simultáneamente. Básicamente están basados en la presencia de oligonucleótidos, ADNc o fragmentos de PCR complementarios al RNAm (o ADNc) de la muestra, que hibridan con estos de forma específica para cada gen en lugares determinados del chip. En este tipo de chip de ARN, se hibrida el RNAm (o ADNc) de dos muestras dife- rentes (por ejemplo, la misma cantidad de ADNc de un control y un enfermo, o bien

“pools” o mezclas de los controles y enfermos) que son marcados, cada uno de ellos con un fluoróforo diferente. La mezcla de ambos es hibridada con los oligonucleóti- dos del mismo chip de ADN. Así, obtendremos una cuantificación relativa del ARN men- sajero original de cada gen basada en la diferencia de señal de los dos fluoróforos entre casos y controles. Finalmente se realizan los cálculos estadísticos pertinentes para detectar diferencias significativas a partir de dichos niveles de fluorescencia y ajustan- do para múltiples comparaciones (Bustin et al., 2002). Los genes en los que observe- mos un incremento o decremento significativo de la expresión, comparados con los controles, se deberán recomprobar posteriormente utilizando la PCR cuantitativa.

2.5. Métodos de estudio de modificaciones epigenéticas.