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Existen múltiples sistemas para realizar la extracción y purificación de ADN genómico a partir de distintos tejidos humanos. Aquí nos centraremos en la meto- dología de análisis una vez se ha obtenido este ADN a partir de alguno de estos méto- dos.

2.1.1. Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain reaction: PCR)

La amplificación enzimática del ADN consiste en la obtención de copias de una secuencia específica de ADN mediante una reacción en cadena de la ADN polimera- sa (PCR). La aplicación de esta metodología en los laboratorios de genética es hoy en día imprescindible.

Las ADN polimerasas son enzimas que llevan a cabo la replicación del ADN. Se obtienen a partir de microorganismos termófilos adaptados a vivir en afloramientos termales, como Termophilus aquaticus. Para ello precisan de una molécula de ADN de cadena sencilla que actúe como molde, un cebador (una moléculaa de ADN de unos 15 a 20 nucleótidos que híbrida con el ADN genómico, al tener una secuencia com- plementaria de esta) y los cuatro tipos de nucleótidos activados o trideoxinucleóti- dos, para ser incorporados en la cadena naciente de forma específica. Estos trideoxi- nucleotidos o dNTPs serán los “ladrillos” a partir de los cuales se irán sintetizando las nuevas cadenas de ADN. Recordemos que químicamente son pentosas unidas a un grupo energético de tres fosfatos en el carbono 5’, a cuatro posibles purinas o pirimi-

dinas diferentes en el carbono 1’y a un grupo hidroxilo en el carbono 3’. Estas serán las adeninas (A), guanosinas (G), citosinas C) y timinas (T).

Recordemos también que las dos hebras de ADN (o los dos cebadores con el ADN) se acoplan normalmente de forma antiparalela mediante enlaces de puentes de hidró- geno entre bases complementarias (A con T y G con C).

Mediante la aplicación de calor y concentraciones salinas adecuadas las dos hebras pueden separarse, se dice entonces que el ADN esta desnaturalizado. Si se restablecen las condiciones iniciales, las hebras de ADN volverán a unirse específicamente por las zonas complementarias, es decir, hibridándose. Ahora resumiremos en que consiste la reacción de PCR: la mezcla de dNTPs, ADN, oligonucleótidos y polimerasa es some- tida a ciclos repetidos de diferentes temperaturas para favorecer la separación de las dos hebras del fragmento de ADN de interés, la hibridación de los oligonucleótidos y su posterior síntesis de cadenas nuevas. A la temperatura de 94°C se separan las cade-

Figura 10. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN se desnaturaliza a 94°C para pos- teriormente hibridar con los oligonucleótidos que tienen una secuencia de cadena complemen- taria a los flancos de la región de ADN que queremos amplificar. El extremo 3’ del cebador esta orientado hacia el interior del fragmento a amplificar para que la polimerasa pueda fabricar una nueva cadena a partir de los dNTP presentes. Al final del primer ciclo de PCR, la cadena inicial de ADN se ha duplicado en dos.

nas de ADN, y después, para favorecer el apareamiento del oligonucleótido con su secuencia complementaria de ADN, se reduce la temperatura hasta un valor especí- fico para cada par de oligonucleótidos (50-65°C). La ADN polimerasa iniciará enton- ces la extensión de la cadena, normalmente a 72°C. Y a partir de aquí se va repitien- do este ciclo unas 30 o 40 veces.

Teóricamente la cinética que sigue la reacción es N x 2n_{, donde N es el núme-}

ro de moléculas iniciales del fragmento diana y n el numero de ciclos de PCR rea- lizados, de forma que sigue un crecimiento exponencial y después de 30 o 40 ciclos habrán millones de copias más que las existentes originalmente (Mullis et al., 1992).

2.1.2. Separación electroforética de ácidos nucleicos

Una vez se ha realizado la extracción de ADN a partir de tejido, o una amplifi- cación de varios fragmentos del mismo, este se puede fraccionar de forma sencilla mediante una electroforesis. La utilidad de hacer esto ya lo veremos más adelante. En este método se dispone el ADN en una matriz semisólida compuesta de un polí- mero previamente estabilizado (agarosa o acrilamida), el cual actúa como una red que dificulta el paso de las moléculas en función de su tamaño. Para inducir el des- plazamiento a través de la matriz se aplica un campo eléctrico y las moléculas se des- plazan hacia el polo positivo. La electroforesis se realiza en un tampón a pH bási- co (usualmente 1xTBE) de forma que las moléculas de ADN están cargadas negativamente. Dado que la relación de carga neta de cada molécula a ese pH es la misma sea cual sea su tamaño, el parámetro discriminatorio para su separación es el tamaño del fragmento. Es decir, las moléculas menores pasarán más fácilmente a través de la malla mientras que las grandes quedarán retenidas o irán mas lenta- mente.

Dependiendo del tamaño de cada una de las moléculas a separar, se pueden uti- lizar diferentes concentraciones de agarosa o acrilamida, lo cual condicionará el tama- ño de los poros en la malla y por tanto la velocidad de los fragmentos que los atra- viesan. Además, la concentración del polímero condicionará el rango de tamaños de ADN dentro de los cuales puede discriminar (ejemplo, una malla muy laxa o con los poros muy grandes no podrá discriminar entre fragmentos de ADN muy pequeños ya que estos pasarán sin ningún “esfuerzo” entre dichos poros). Los polimeros de acri- lamida crean una malla mas uniforme que las de agarosa y son capaces de discrimi- nar diferencias de tamaño más precisos (Sambrook et al., 2001).

La tabla siguiente ofrece una idea del rango de concentraciones del cada políme- ro, dependiendo del tamaño de fragmentos a separar.

Tabla. Rango efectivo de separación de moléculas de DNA en pares de bases (pb) en geles de A) acrilamida bis acrilamida 29:1 y B) agarosa (tabla de Sigma-Aldrich). Junto con la mues- tra se cargan dos colorantes a partir de los cuales se puede ir observando en tiempo real como se produce la movilidad dentro del gel (Azul de bromofenol y xilencianol). La movi- lidad de esos colorantes en el gel se especifica como equivalencia en pares de bases.

A) Concentración Acrilamida (%) ADN (pb) Xilen cianol (pb) Azul de bromofenol (pb)

3.5 1000-2000 460 100 5.0 50-500 260 65 8.0 60-400 160 45 12.0 40-200 70 20 15.0 25-150 60 15 20.0 6-100 45 12

B) Concentración de agarosa % ADN (pb) 0.3 5000-6x104 0.6 1000-2x104 0.7 800-1000 0.9 500-700 1.2 400-600 1.5 200-300 2.0 100-200

Después, para visualizar las bandas en el gel (correspondientes a los diferentes frag- mentos de ADN) es necesario teñir el gel en una solución de bromuro de etidio, el cual se une al ADN con gran afinidad, y se observa posteriormente mediante una lámpa- ra de luz ultravioleta. La luz ultravioleta produce fluorescencia en el ADN unido al bro- muro de etidio. También pueden ser utilizados otros métodos para teñir el ADN y poder observarlo dentro del gel, como la tinción con plata (Sambrook et al., 2001).

2.1.3. Mutaciones o polimorfismos

Cambios en la composición del ADN se denominan mutaciones o polimorfis- mos. Por conveniencia, cuando una mutación esta presente en menos del 1% de la población y no genera ningún fenotipo patológico se le suele denominar polimorfis- mo. Llamaremos fenotipo a la expresión del genotipo en un determinado ambiente. Los rasgos fenotípicos incluyen rasgos tanto físicos como conductuales.

Podemos distinguir varios tipos de cambios o mutaciones del ADN:

– Cambios sencillos de nucleótidos. Una base -o nucleótido- es substituida por otra distinta. En este caso existirán dos alelos dentro del mismo locus, uno

mutado y otro normal (en genética de poblaciones, llamado alelo salvaje o wild). Por conveniencia utilizaremos las siglas en ingles SNP (single nucleotide poly- morphism) para este tipo de polimorfismos.

– Pequeñas deleciones o inserciones. Un número reducido de nucleótidos se pier- den o insertan, alterando la secuencia y tamaño de la molécula de ADN. Puede incluir desde una deleción/inserción de una sola base a uno o varios exones den- tro de un gen. En estos casos existe la posibilidad de que se rompa el marco de lectura, esto es, que ha partir de donde se produzca la inserción/deleción se cam- bie la interpretación en la traducción y se cambie completamente la secuencia de la proteína original, dando lugar probablemente a una proteína sin función metabólica.

– Cambios en el número de repeticiones de una secuencia de ADN. Entre ellas se encuentran las mutaciones microsatélites, que son repeticiones en tandem de secuencias de entre 2 y 4 pares de bases (pb), y minisatélites, que son repeticio- nes de pb de entre 6 y 100 pb. Algunas mutaciones microsatélites son inesta- bles o dinámicas debido a que el número de repeticiones de estas variantes puede variar de una generación a otra. Este número de repeticiones puede estar directamente asociado con la patogenicidad (Ejemplo: Hungtintina en la enfer- medad de Hungtinton).

– Grandes reorganizaciones. Ganancias, pérdidas o cambios en la orientación de grandes fragmentos de ADN. Estas reorganizaciones pueden incluir a un gen ente- ro o un grupo de genes, y a veces es posible visualizarlas en el cromosoma en metafase mediante el microscopio.

El posible efecto funcional o no de este tipo de cambios en la proteína resultan- te puede venir dado por diversos factores: Que se produzca un cambio en la secuen- cia de la proteína o bien una proteína truncada, o bien que se altere la estabilidad del RNA mensajero (ARNm) o cambios en la expresión génica, que darían lugar a cam- bios en los niveles de proteína etc. Dicho de otra manera, la forma en que una muta- ción causa una determinada enfermedad, o alguna característica fenotípica puede venir dado por diferentes mecanismos.

Además, aún en el caso de que la mutación genética produzca un cambio en la secuencia de la proteína resultante, por ejemplo mediante un cambio de aminoáci- do por otro, no necesariamente provoca un cambio en la funcionalidad de la prote- ína, ya que esto dependerá de las características fisicoquímicas del aminoácido cam- biado y de la región o dominio de la proteína donde se haya producido la mutación. Dicho de otra manera: un cambio genético no tiene porque causar alteraciones en el fenotipo. Por ejemplo, cuando encontramos una mutación en un gen candidato para alguna enfermedad hemos de asegurarnos que sea efectivamente patogénica. Para

ello tenemos varias posibilidades. 1) Si se trata de un caso familiar hacer un estudio de cosegragación, es decir determinar si dentro de una familia la mutación aparece presente en los enfermos y no en los miembros sanos. 2) Genotipar cientos de indi- viduos en la población general para determinar la posible presencia de esa mutación. Si no esta presente será más probable que se trate de una mutación patogénica y no de un polimorfismo inocuo. 3) Predicciones informáticas que computan la probabi- lidad de que un determinado SNP, dentro de una secuencia determinada, pueda cau- sar alteraciones en alguna actividad biológica, o en el splicing alternativo, la expresión etc (Ejemplo en http://pupasuite.bioinfo.cipf.es) 4) Estudios funcionales (modelos animales, celulares etc) con los que podamos comprobar si la mutación causa una alte- ración funcional de la proteína mutada.

2.1.4. Concepto de Haplotipo, desequilibrio de ligamiento y tagSNP. Proyecto HapMap

Es importante comprender bien este concepto, ya que todos los polimorfismos y mutaciones están formando haplotipos, y su utilización es muy útil en la búsqueda de genes que influyen en un determinado fenotipo (Lee et al., 2005). Recordemos que para cada par de cromosomas recibimos una cromátida diferente de cada progenitor, con lo cual recibimos también una dotación de mutaciones y polimorfismos de uno y de otro. Es decir, hay una serie de mutaciones en la misma cadena de ADN que se transmiten todas juntas: esto es un haplotipo. Teóricamente pues, un haplotipo esta- ría constituido por cada uno de los cromosomas. No obstante, en cada generación se produce recombinación entre diferentes cromátidas, mezclándose las cadenas de ADN y, por consiguiente, también los diferentes polimorfismos de cada progenitor. Esta recombinación no es totalmente al azar, ya que hay zonas de “hot spots”,o luga- res con mayor probabilidad de recombinación, con lo cual los polimorfismos entre dos áreas “hot spots” o de recombinación contiguas tenderán a seguir transmitiéndo- se en bloque y conservándose a lo largo de muchas generaciones. Aquí estarían ”ence- rrados” toda una serie de polimorfismos que estarían formando un bloque de muchos haplotipos. Así, cuando dos polimorfismos están dentro del mismo haplotipo no segregan independientemente en cada generación, sino siempre juntos, se dice enton- ces que ambos polimorfismos están en desequilibrio de ligamiento completo. Como hemos dicho, hay que tener en cuenta que la recombinación meiótica puede actuar en contra de la conservación de los haplotipos antiguos, por eso el desequilibrio de ligamiento completo entre dos polimorfismos puede ir desapareciendo con el tiem- po, pasando por estadios de desequilibrio de ligamiento parcial. Veámoslo con un ejem- plo. Imaginemos dos SNPs, ambos dentro del mismo par de cromosomas, el SNP1 con dos alelos A y T, y el SNP2 con los alelos G y C. Para un individuo dado hay tres

genotipos posibles para cada SNP (en negrita) y nueve teóricas combinaciones de haplotipos. En la siguiente tabla lo veremos mejor. En el caso de que el SNP1 tenga el genotipo AA y el SNP2 el genotipo GC, no habrá indeterminación acerca de los haplo- tipos existentess: estarán presentes el haplotipo A-G y el haplotipo A-C. Observamos que en el caso de los heterocigotos dobles hay dos posibles combinaciones indeter- minadas de haplotipos que podrían existir marcado con interrogante, o dicho de otra manera la fase es ambigua.

AA AT TT

GG (A-G / A-G) (A-G / T-G) (T-G / T-G)

(A-G / T-C)?

GC (A-G / A-C) o bien (T-G / T-C)

(A-C / T-G)?

CC (A-C / A-C) (A-C / T-C) (T-C / T-C)

Se pueden resolver los haplotipos ambiguos, pero requieren sistemas trabajosos de clonaje y posterior secuenciación. Sin embargo, cuando se conocen los genotipos de un número elevado de individuos, es posible inferir estadísticamente los haploti- pos en los casos ambiguos. Esto se hace utilizando métodos de combinatoria, o fun- ciones de máxima verosimilitud combinados con algoritmos EM (Expectation-maxi- mization) y pudiendo ajustar con covariables (Chen et al., 2008). Existen multitud de programas informaticos de libre uso para realizar estos cálculos por ejemplo UNPHA- SED (http://linkage.rockefeller.edu/soft/list4.html). Esto puede ser util para realizar estu- dios de asociación caso-control, para comparar estadisticamente si existen diferencias significativas entre las frecuencias haplotipicas de un grupo control y el grupo de casos patológicos, o bien relacionando un determinado haplotipo con algun rasgo cuan- titativo de la conducta.

Todo esto nos lleva al concepto de tagSNP. Como existen muchos polimorfismos que se transmiten en un determinado bloque seria redundante genotiparlos todos, por el contrario si sabemos que existe un desequilibrio de ligamiento completo podemos genotipar solo uno de ellos, el cual nos estará dando información sobre toda la serie de polimorfismos asociados a ese tagSNP.

Como derivación del Proyecto Genoma Humano, se ha realizado una base de datos en la que se describen las diferentes estructuras haplotípicas en varias poblacio- nes humanas analizando cientos de miles de SNPs distribuidos a lo largo de todo el genoma. Se ha utilizado ADN de doscientos setenta individuos de cuatro poblacio- nes diferentes (con ancestros Europeos, africanos o asiáticos). Esto ha permitido deter- minar a grandes rasgos las frecuencias genotípicas de cada polimorfismo conocido en

cada una de las poblaciones y su estructura haplotípica particular. El International HapMap Project (www.hapmap.org), ha creado así una base de datos accesible para su utilización por la comunidad científica. Con este medio es posible seleccionar el mínimo número de tagSNP en una población, que aporten la máxima información de una región genética en concreto. Para más detalles consultar el artículo Thorisson et al. A User’s guide to the International HapMap project web site (http://www. hapmap.org/downloads/presentations/users_guide_to_hapmap.pdf).