células) de 0,1. Tras 1 h de absorción a 15 oC para VNHI y a 20 oC para VNPI, se eliminó el medio de crecimiento y la monocapa se lavó con tampón PBS (pH 7,4). A continuación, se añadieron diferentes concentraciones (desde 10 µg mL‐1 hasta 1000 µg mL‐1) de cada uno de los dextranos independientemente y se mantuvieron los tratamientos durante 3 días a 20 oC para VNPI y 5 días a 15 oC para VNHI. Para determinar la cantidad de virus infectivo, se lisaron las células sometiéndolas a tres ciclos de congelación y descongelación, y se recogieron los sobrenadantes tras centrifugación a 3000 x g 10 min. Éstos se congelaron a –70 oC hasta su uso. La cantidad de virus (intra y extracelular) fue determinada mediante infección de monocapas de células, calculando el TCID50 mL‐1. 3.3.1.4. Ensayo in vitro del efecto del momento de adición Para identificar en qué fase del ciclo reproductivo de los virus actuaban los EPS inhibiendo la infección, se llevó a cabo un ensayo del momento de adición. Para ello, en placas de 48 pocillos se sembraron 5 x 104 células por pocillo (EPC o BF‐2), a las cuales se les añadieron el EPS‐LS, el EPS‐LM y el dextrano T2000 a 1000 µg mL‐1 30 min antes, al mismo tiempo o 1 h después, de la infección con los virus (VNHI o VNPI) a una MOI de 1. Las placas fueron incubadas durante 3 días a la temperatura óptima para cada virus y finalmente se recuperaron las células por raspado. La concentración de virus infectivo se determinó mediante infección de monocapas de células, calculando el TCID50 mL‐1.
3.3.1.5. Ensayos in vivo
Los ensayos in vivo se realizaron con alevines de trucha arco iris. Los experimentos descritos cumplen con la Directiva 86/609/EU del Parlamento Europeo y del Consejo para el uso de animales de laboratorio. Los peces se mantuvieron en un régimen de 12 h de luz y 12 h de oscuridad a 15 °C en tanques cerrados de 350 L de agua con recirculación en el CIB y se alimentaron dos veces al día con una dieta de gránulos comerciales (3 % de su peso corporal) [135]. Previa a la realización de los
anestesiaron, antes de su manipulación, por inmersión en 50 μg mL‐1 de metanosulfonato de tricaina (Sigma‐Aldrich). Para realizar los experimentos, se distribuyendo a los peces en siete grupos (n = 20): i) grupos 1 y 2, tratados durante tres días con 10 μg por pez de EPS‐LS diluido en NaCl al 0,85 %; ii) grupos 3 y 4, tratados durante tres días con 50 μg por pez del EPS diluido en NaCl al 0,85 % y iii) grupos 5, 6 y 7, se manipularon del mismo modo que los grupos anteriores durante tres días pero sin tratar con ningún compuesto. La administración del EPS‐LS se realizó usando una pipeta automática con una punta de 20 μL que se introdujo en la boca del pez, apoyando el extremo de la punta en la entrada del esófago. Al tercer día de tratamiento, los peces de los grupos 1, 3 y 5 se infectaron por inmersión con el virus VNHI (5 x 105 TCID50 mL‐1), y los grupos 2, 4 y 6 se infectaron con el virus VNPI (5 x 105 TCID50 mL‐1) [136]. Tanto los parámetros de calidad del agua como las condiciones de cultivo fueron equivalentes en todos los tanques. Los grupos de ensayo se mantuvieron en observación para vigilar los signos clínicos y la tasa de mortalidad durante 30 días. 3.3.2. Actividad inmunomoduladora 3.3.2.1. Efecto inmunomodulador en trucha arcoíris Para los ensayos de estimulación in vivo se utilizaron grupos de peces a los que se les inyectó intraperitonealmente EPS‐LS (50 μg mL‐1), poli I:C (25 μg mL‐1) o tampón PBS (pH 7,4). A los días 1, 3, 7 y 15 de tratamiento se sacrificaron peces (n=3) a los que se les extrajo RNA total del tejido de la parte anterior del riñón, con el fin de evaluar la expresión de los genes IFN‐1 e IFN‐γ por RT‐qPCR.
La extracción de RNA se realizó con Trizol (Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante y tratando las muestras con DNAsa I, para eliminar las trazas de DNA que pudieran interferir, utilizando el kit RQ1 DNasa I libre de RNasas (Promega, Wisconsin, EEUU) y siguiendo las especificaciones de la casa comercial. La síntesis de los cDNA, se realizó con la transcriptasa reversa SuperScript III (Invitrogen). Las muestras (12 μl ) se incubaron a 65 °C durante 5 min con 1 μl de oligo (dT)12‐18 (0,5 μg
mL‐1) y 1 μl de una solución conteniendo los 4dNTPs (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), cada uno de ellos a una concentración de 10 mM, y se mantuvieron posteriormente 1 min a 4 °C. Seguidamente a cada muestra se le añadieron: 4 μl de tampón 5X (250 mM Tris‐ HCl pH 8,3, 375 mM de KCl y 15 mM de MgCl2), 1 μl de DTT (0,1 M) y 200 U de la transcriptasa reversa, incubándose la mezcla de reacción durante 1 h a 50 °C. La reacción se detuvo calentando a 70 °C durante 15 min. El cDNA resultante se diluyó a la concentración deseada en agua destilada estéril, siendo conservado a ‐20 °C hasta su uso. Para la qPCR se utilizó 12,5 μL del iQ™ SYBR® Green Supermix 2x (Bio‐Rad), 1 μL de los cDNAs diluidos cuatro veces y 0,3 μM de cada pareja de primers de los genes IFN‐1, IFN‐γ y el factor de elongación 1‐α (Tabla 2M). Para llevar a cabo la reacción las condiciones fueron las siguientes: i) un ciclo de 10 min a 95 oC; ii) 40 ciclos de 10 s a 95 oC y 1 min a 60 oC y iii) un ciclo de 1 min a 95 oC y 1 min a 60 °C en un iQ5 iCycler thermal cycler (Bio‐Rad). Los valores de expresión fueron normalizados respecto al control endógeno (el factor de elongación 1‐α). Los cambios de expresión obtenidos respecto al control fueron calculados por el método 2‐ΔΔCt [137]. 3.3.2.2. Actividad antiinflamatoria en macrófagos de ratón Los ensayos se realizaron en colaboración con el grupo de los Drs. Daniel Gozalbo Flor y Marisa Gil Herrero, Catedráticos del Departamento de Microbiología y Ecología, de la Universidad de Valencia. 3.3.2.2.1. Aislamiento y cultivo in vitro de macrófagos peritoneales de ratón
La obtención de macrófagos intraperitoneales se realizó a partir de ratones C57BL/6, en condiciones de esterilidad mediante su manipulación en cabina de flujo laminar y utilizando material quirúrgico estéril. Tras su sacrificio por dislocación cervical, se bañó al ratón con alcohol de 70 oC y se le inyectó 10 mL de medio RPMI completo (Gibco, Invitrogen). A continuación se masajeó la cavidad peritoneal del animal, para distribuir bien el medio de cultivo, y se realizó un corte en el peritoneo
durante 10 min a 4 oC y, tras el recuento de los macrófagos al microscopio, las células se resuspendieron en medio RPMI completo para dejarlos a una concentración final de 1,15 x 106 células mL‐1. Durante todo el proceso, la manipulación de las células peritoneales se realizó en frío para evitar la adherencia de las células al plástico. 3.3.2.2.2. Preparación de estímulos El EPS‐LS y el EPS‐LM se trataron con 20 µg mL ‐1 de polimixina B (Sigma‐Aldrich) durante 1 h y se filtraron por 0,45 µm para eliminar posibles endotoxinas. Los estudios se realizaron independientemente con cada uno de los dextranos a una concentración final de 50 µg mL‐1 disueltos en tampón PBS (pH 7,4) y con diferentes compuestos que desencadenan respuestas proinflamatorias. Así, se utilizó el lipopolisacárido (LPS) de
Escherichia coli a 0,25 µg mL‐1; Zymosan, partículas de paredes celulares de
Saccharomyces cerevisiae a 100 µg mL‐1; levaduras de Candida albicans a 107 mL‐1, y el curdlano, (1,3)‐β‐glucano lineal de Alcaligenes faecalis a 20 µg mL‐1. 3.3.2.2.3. Estudios de producción in vitro de citoquinas Para los estudios de producción in vitro de citoquinas, 200 µL de la suspensión de macrófagos (2,3 x 105 células por pocillo) se incubaron en placas de 96 pocillos durante 72 h a 37 oC en una atmósfera de CO2 al 5 %. Transcurrido dicho tiempo, los estímulos se añadieron durante 24 h a 37 oC en una atmósfera de CO2 al 5 %. Tras la estimulación de las células se recogió el medio de cultivo y se centrifugó a 16.000 x g durante 5 min para recoger los sobrenadantes libres de cualquier resto celular. Estos se guardaron a – 80 oC hasta su análisis.
La producción de citoquinas proinflamatorias (TNF‐α e IL‐6) se determinó utilizando los sobrenadantes de los cultivos celulares, mediante la técnica ELISA con los kits comerciales de eBioscience (San Diego, EEUU), siguiendo las indicaciones del fabricante.
3.4. Detección y localización genómica de los genes dsr en Lb. sakei MN1 y Lc.