Para el estudio de la expresión génica de dsrLS se obtuvieron preparaciones de RNA total a partir de cultivos de Lb. sakei MN1 crecidos en CDMG y CDMS. Con el fin de determinar si existían transcritos conteniendo dsrLS y otros genes circundantes y si los niveles de mRNA se veían afectados por la presencia de glucosa o sacarosa en el medio de cultivo, se realizaron 5 reacciones de RT‐PCR para generar los amplicones que se muestran en la figura 21R, A. Los resultados del análisis electroforético en gel de agarosa revelaron que todas las reacciones generaron el amplicón del tamaño esperado, excepto la 5 que no generó ningún producto (Fig. 21R, B). Este último resultado era también esperado debido a la polaridad convergente de dsrLS y orf2 y a la existencia de un terminador transripcional putativo localizado a continuación del extremo 3´ del gen dsrLS, que hacían preveer la falta de cotranscripción del gen dsrLS y la orf2.
Figura 21R. Detección por RT‐PCR de los niveles de mRNA. (A) Mapa físico de pMN1, en el cual se indican los 5 amplicones esperados como productos de 5 reacciones de RT‐PCR generadas respectivamente con los oligonucleótidos rt1F y rt1R (1); P2F y rt2R (2); P3F y rt2R (3); rt2F y rt2R (4); rt3F y rt3R (5) (Tabla 2M). (B) Análisis en geles de agarosa de las reacciones de RT‐PCR realizadas utilizando preparaciones de RNA total obtenidas a partir de cultivos crecidos en glucosa (G) o sacarosa (S). Marcador de peso molecular (SmartLadder, Eurogentec) (M).
Respecto a los amplicones detectados, la cuantificación de la intensidad de las bandas indicó que los niveles de mRNA no variaban de forma notable cuando los cultivos se crecieron en presencia de sacarosa en lugar de glucosa. Además, los resultados obtenidos mostraron una inesperada cotranscripción de dsrLS con los genes repA y repB. 4.5. Identificación de regiones promotoras en pMN1 Con el fin de detectar posibles regiones promotoras en el plásmido pMN1 de Lb.
sakei MN1 se amplificaron independientemente las regiones A, B y C, localizadas
corriente arriba de repA, orf1 y dsrLS (Fig. 20R), respectivamente, y se clonaron en el plásmido pRCR [118] (apartado 3.6 del capítulo de materiales y métodos). Los insertos se localizaron corriente arriba del gen sintético mrfp, que codifica la proteína fluorescente mCherry, una versión monomérica de la proteína fluorescente roja de
Dicosoma sp., y cuyos codones están optimizados para lograr su expresión eficiente en
BAL [139]. Así se obtuvieron los plásmidos pRCR13, pRCR14 y pRCR15 que contienen las regiones A, B o C, respectivamente (Fig. 22R).
Los clonajes se realizaron en la cepa L. lactis MG1363 y posteriormente los plásmidos fueron transferidos a Lb. sakei MN1. También se transfirió a dicha bacteria el plásmido pRCR12 para ser utilizado como control positivo de expresión. Este plásmido contiene la fusión transcripcional del promotor fuerte Px, del gen malX de S.
pneumoniae, al gen mrfp, que confiere fluorescencia a lactobacilos [119]. Además, como control negativo se utilizó la estirpe parental Lb. sakei MN1 carente de fluorescencia.
Figura 22R. Diagrama de los plásmidos construidos pRCR13, pRCR14 y PRCR15 a partir del plásmido pRCR. Se muestran los sitios de restricción más relevantes, así como el gen mrfp, que codifica la proteína mCherry, y el gen cat, que codifica una cloranfenicol acetil transferasa responsable de la resistencia a cloranfenicol. A, B y C hacen referencia a las regiones insertadas en pRCR.
Todas las bacterias fueron cultivadas en MRSG y MRSS y analizadas mediante microscopía óptica de contraste de fases y de fluorescencia (Fig. 23R). Como se esperaba, la presencia de pRCR12 confirió fluorescencia a Lb. sakei MN1. Además, las células portadoras de pRCR13 y pRCR15 también mostraron fluorescencia en los dos medios utilizados tanto en la fase exponencial como en la fase estacionaria de crecimiento. Sin embargo, no se detectó fluorescencia en las células portadoras de pRCR14 en ninguna de las condiciones ensayadas.
Figura 23R. Análisis de estirpes portadoras del gen mrfp por microscopía óptica. Se muestran las imágenes obtenidas por microscopía de contraste de fases (parte superior derecha), por microscopía fluorescencia (parte superior izquierda), y el solapamiento de ambas (parte inferior izquierda), de cultivos de las bacterias, crecidos en medio con glucosa o sacarosa, en las fases de crecimiento exponencial y estacionaria.
Posteriormente se procedió a cuantificar la fluorescencia de los cultivos bacterianos. Así, la detección de los niveles de la proteína autofluorescente mCherry activa se realizó en cultivos de las cepas crecidas en medio MRSG o MRSS, tras la sedimentación de las células y su concentración (20 veces) por resuspensión en tampón PBS (pH 7,4). Se realizó una determinación simultánea de la A480nm como medida del crecimiento bacteriano y de la fluorescencia de las bacterias. En la tabla 5R aparecen recogidos los niveles de fluorescencia normalizados para la biomasa celular estimada por los valores de A480nm. Los resultados obtenidos confirmaron que en las regiones clonadas A y C y no en la región B, existían promotores transcripcionales, ya que se observaron niveles de fluorescencia significativos en las cepas MN1[pRCR13] y MN1[pRCR15], mientras que en la cepa MN1[pRCR14] sólo se detectaron los mismos niveles que en la estirpe parental Lb. sakei MN1 carente de plásmido recombinante (Tabla 5R). Además, la comparación de los niveles de fluorescencia mostró que, en todas las condiciones probadas, la transcripción desde Px era la más elevada y que el promotor presente en la región A era más fuerte que el localizado en la región C (Tabla 5R).
Tabla 5R. Relación de intensidad de fluorescencia respecto a la biomasa celular.
Cepa Fase exponencial Fase estacionaria
Glucosa Sacarosa Glucosa Sacarosa
Lb. sakei MN1 0,126 ± 0,06 0,091 ± 0,01 0,047 ± 0,01 0,044 ± 0,05 Lb. sakei MN1[pRCR12] 35,5 ± 3,0 35,1 ± 1,8 22,7 ± 1,4 13,9 ± 0,6 Lb. sakei MN1[pRCR13] 14,2 ± 1,4 7,6 ± 0,7 14,9 ± 1,1 6,8 ± 0,2 Lb. sakei MN1[pRCR14] 0,463 ± 0,04 0,200 ± 0,02 0,551 ± 0,03 0,157 ± 0,01 Lb. sakei MN1[pRCR15] 7,3 ± 0,3 2,8 ± 0,2 4,0 ± 0,1 0,9 ± 0,1
Además, los niveles de fluorescencia fueron iguales en MRSS y MRSG para las células portadoras de pRCR12 en la fase exponencial, y ligeramente superiores en MRSG (2 veces) en las estirpes portadoras de pRCR13 y pRCR15 (Tabla 5R). Este hecho podría ser debido a que la presencia del dextrano en los cultivos crecidos en MRSS podría provocar un apantallamiento que enmascarara la fluorescencia. Sin embargo, el
análisis por microscopia de fluorescencia también reveló en células individuales una menor fluorescencia en bacterias crecidas en medio MRSS (Fig. 23R) y, en ambos casos, las células fueron lavadas repetidas veces para eliminar el dextrano. Independientemente de la causa de estas diferencias en fluorescencia, los resultados revelaron que en presencia de sacarosa no hay una inducción transcripcional a partir de los promores presentes en las regiones A y C. 5. CAPACIDAD DE AGREGACIÓN Y FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN RELACIÓN A LA PRODUCCIÓN DE DEXTRANO
Durante el desarrollo de este trabajo, se observó que Lb. sakei MN1 y Lc.
mesenteroides RTF10 presentaban características diferenciales de crecimiento en
medio líquido en presencia de glucosa, lo que condujo a un estudio en profundidad de este comportamiento.
5.1. Análisis de la capacidad de agregación y de formación de biopelículas de Lb.