Respecto al producto génico de dsrLS (DsrLS) la secuencia deducida reveló que es una proteína compuesta por 1.767 aminoácidos que posee una masa molecular de 190.039 Da y, por homología con otras proteínas presentes en la base de datos, que se trata de una glucansacarasa. Este tipo de enzimas, como la DsrLS, son proteínas con una masa molecular promedio de 160.000 Da, que presentan cuatro dominios basándose en su secuencia de aminoácidos (apartado 2.1 del capítulo de introducción): i) un péptido señal; ii) una región variable; iii) un dominio catalítico y iii) un dominio C‐terminal, donde se ha postulado que se encuentran los dominios de unión al glucano.
Hasta la fecha no se ha conseguido determinar experimentalmente la estructura 3D completa de ninguna glucansacarasa. Sólo se han obtenido, por estudios de cristalización y análisis por difracción de rayos X, las estructuras parciales de: i) la proteína DSR‐E‐ΔN de Lc. mesenteroides NRRL B‐1299 (PDB: 3TTQ); ii) la GTF‐SI de S.
mutans (PDB: 3AIE); iii) la GTFA‐ΔN de Lb. reuteri 121 (PDB: 4AMC) y iv) la GTF180‐ΔN
de Lb. reuteri 180 (PDB: 3KLK, 4AYG, 3HZ3). A partir de dichas estructuras cristalinas resueltas, se ha determinado que existen 5 dominios estructurales denominados A, B, C, IV y V [166]. La nomenclatura de dichos dominios ha sido establecida en base a su alineamiento estructural con los dominios A, B y C de la familia GH13 (α‐amilasas). Los otros dos dominios (IV y V) no presentan similitudes estructurales con dominios de la familia de las GH13, por lo que se utiliza para ellos una nomenclatura diferente [173]. Estos dominios no se encuentran de forma consecutiva en la cadena polipeptídica, sino que se disponen en forma de “U” siguiendo el patrón V, IV, B, A, C, A, B, IV y V (Fig. 5D).
Figura 5D. Estructura 3D de la glucansacarasa GTF180‐ΔN de Lb. reuteri 180 (A) y modelado de la estructura de DsrLS de Lb. sakei MN1 (B). Se muestran en ambos casos los 5 dominios estructurales (A en azul, B en verde, C en morado, IV en amarillo y V en rojo), así como las posiciones aminoacídicas de cada uno de ellos. En el caso de Lb. reuteri ha sido obtenida a partir de los datos de difracción de rayos X del cristal. En el caso de Lb. sakei se ha generado del modelo obtenido a partir de la estructura de GTF180‐ΔN con el programa I‐TASSER [128] La secuencia de aminoácidos de la proteína DsrLS (desde el 396 al 1395) muestra una identidad del 48,18 % con los residuos de la proteína GTF180‐ΔN de Lb. reuteri 180 (PDB 3HZ3) (Fig. 5D y anexo II.III). Basado en esta homología ha sido posible establecer un modelo de la estructura 3D de DsrLS, con excepción de sus regiones N y C‐terminal, el cual predice la existencia de los mismos dominios existentes en su homónima de Lb. reuteri 180 (Fig. 5D y 6D). El dominio A comprende un barril (β/α)8 y contiene el sitio catalítico del enzima. El análisis del alineamiento estructural del modelo de DsrLS sugiere que los aminoácidos que configuran el centro catalítico del enzima constituyen una tríada compuesta por dos residuos aspartatos (D678 y D789) y un residuo glutamato (E716) (Fig. 7D).
Figura 6D. Superposición del modelo estructural de DsrLS (en rojo) y de la estructura cristalina de GTF180‐ΔN (en verde). Superposición realizada con el programa CE [129] ejecutado en el servidor http://source.rcsb.org.
Figura 7D. Modelo de interacción de los aminoácidos del centro catalítico de DsrLS con el sustrato sacarosa (en granate). Obtenido por la superposición del modelo 3D de la proteína DsrLS sobre el cocristal de la proteína GTF180‐ΔN y su sustrato sacarosa.
Se ha demostrado que la presencia de calcio es esencial para la actividad de la GTFA‐ΔN de Lb. reuteri 121 [174] y la GTF180‐ΔN de Lb. reuteri 180 [173]. El dominio B, situado adyacente al dominio catalítico, parece ser esencial para la función de las glucansacarasas por dos motivos: i) residuos del dominio A y B forman el sitio de unión
a calcio y ii) algunos bucles del dominio B contribuyen a dar forma al dominio A. Por lo que respecta al dominio C, aunque esta conservado en las glucansacarasas, todavía no tiene adscrita una función. El dominio IV conecta los dominios B y V y se ha estipulado que podría actuar a modo de “bisagra” para acercar el domino V al centro catalítico [175]. El domino V está formado por las regiones N‐ y C‐terminal, que presentan una serie de módulos estructurales que contienen dos o tres “β2/β3 unidades” de aproximadamente 20 residuos. Así pues, en las glucansacarasas existen repeticiones en tándem A‐/C‐ o bien repeticiones YG que forman bloques, en sus dos extremos terminales, formando el dominio V. En el caso de Lb. sakei MN1, la dextransacarasa no presenta repeticiones de tipo A‐/C‐, pero si YG en ambos extremos. Las diferencias entre las glucansacarasas están determinadas por el número de bloques, así como por la forma en que estos estén conectados y empaquetados debido a su secuencia.
En las especies de Lactobacillus, el extremo N‐terminal presenta entre 200 y 700 residuos y, mutaciones o delecciones en dicha región, pueden alterar su función. Así, en el caso de GTFA, afectan a la relación entre la actividad hidrolítica y la actividad transglicosidasa [174]. Por lo que respecta al extremo C‐terminal, está compuesto por aproximadamente 300 residuos y se le han atribuido implicaciones en diferentes funciones: i) en la polimerización o estructura del glucano; ii) en la transferencia de productos al centro catalítico y iii) en la localización de la proteína en la superficie celular. En el caso de la GTFA su delección disminuye la afinidad por la sacarosa [174]. Sin embargo, el papel concreto de esta región C‐terminal todavía se desconoce [176]. Las repeticiones de la región C‐terminal de las glucansacaras presentan homología con los motivos de unión a la pared celular presentes en las proteínas de unión de colina, toxinas y otras proteínas de superficie localizadas en varias bacterias [166]. La proteína DsrLS presenta 307 aminoácidos en su región C‐terminal que están presentes en menor medida en la proteína GTF124 y Kg15, pero no se encuentran en la proteína de
Lb. reuteri 180 (anexo II.II). Ha sido posible modelar el plegamiento general del
fragmento C‐terminal de DsrLS (Fig. 8D), identificado por métodos de “threading”, a partir de la estructura 3D de uno de los monómeros (cadena A) de la proteína homodimérica PcsB de S. pneumoniae [177] (PBD 4CGK y Fig. 8D, B). PcsB es una
separación de las células hijas y que posee actividad muralítica [177]. Cada cadena monomérica de PcsB contiene tres regiones características: i) un dominio “coiled‐coil” (CC, residuos 41‐266); ii) una región conectora (residuos 267‐278) y iii) un dominio CHAP (residuos 279‐392), que contiene el centro catalítico del enzima. La homología estructural de DsrLS con PcsB incluye los residuos 1422‐1767 de la dextransacarasa y los residuos 42‐355 del enzima de S. pneumoniae. En consecuencia, DsrLS posee un dominio CC, una región conectora y un domino CHAP incompleto y presumiblemente sin actividad catalítica. En el caso de PcsB el dominio CC está compuesto de cinco α‐ hélices (Fig. 8D, B): i) tres largas hélices curvadas con un número elevado de residuos (α1, α3 y α4), las dos primeras antiparalelas y la tercera con la misma polaridad que la primera, y ii) dos hélices cortas (α2 y α5). En el caso de DsrLS (Fig. 8D) existe, además de estas 5 α‐hélices, otra hélice extra localizada en el extremo N‐terminal del fragmento (denominada α1*) con polaridad contraria a la hélice α1. Los dominios CC contienen secuencias repetidas que conllevan a un plegamiento, con una estructura secundaria de tipo α‐hélices incluyendo residuos hidrofóbicos los cuales contribuyen a la interacción entre cadenas.